A green approach for the recovery of chlorophyll from unsold spinach: stabilization and encapsulation
Author(s)
Mazzocchi, Caterina
Date Issued
March 14, 2025
Type
Doctoral Thesis
Abstract
Food waste represents a major problem from an economic and environmental point of view. In the perspective of the Circular Economy, food waste may be an excellent source for the recovery of high added value molecules, such as colorants. Riding the wave of ever-increasing demand of natural colorants recovered by green methods, the aim of this PhD thesis project is to develop a custom-made protocol for the extraction, stabilization and encapsulation of chlorophyll (Chl) from vegetable waste, to be used as a natural food colorant. A tailored Enzyme-Assisted Extraction (EAE) approach has been developed for the conservative recovery of Chl-containing chloroplast from unsold spinach, ensuring the stability and protection of pigment. Furthermore, since Chl can undergo a series of reactions leading to the loss of central magnesium, the use of zinc as substituent (able of restoring stability) has been studied. The plant matrix was characterized in terms of cell wall polysaccharide composition, and a tailored enzymatic mix based on cellulase (40%) xylanase (41%) and polygalacturonase (19%) was formulated. The process variables [temperature (°C), time (h), enzyme mix dose (U/g), ZnCl2 concentration (ppm), and buffer/substrate ratio (B/S)] and their interactions were studied by Response Surface Methodology (RSM). The overlay plot made it possible to identify the process conditions (T: 25 °C, Zn: 150 ppm e B/S: 17.5, t: <2 h and enzyme mix dose between 12 and 45 U/g) to maximize the amount of Chl, and concurrently, the quality of the green color of the extract. The novel colorant was, then, applied in the production of a real food (baghrir). Moreover, the Chl extraction kinetic and recovery yield was further investigated using an organic solvent-free method, based on limited dosing options (biocatalyst and ZnCl2) for the quick and mild recovery of Chl. The kinetic of pigment extraction turned out to be a very useful tool to identify the proper conditions, in terms of biocatalyst dose (0.10–50 U/g), extraction time (1–48h), and ZnCl2 amount (50–300 ppm), both for enhancing the recovery yield and preserving the greenness. Considering the extraction kinetic, the recovery yield, and the colorimetric data, the suitable conditions to produce a stable green and food-grade colorant are: 0.10 U/g of enzyme, 3h, and 150 ppm of ZnCl2 at 25 °C. The extraction yield of Chl (4863μg/U) was about 51% greater than control, with a higher extraction rate constant (5.43 × 10−4 g/(μg min)). Considering the impact of ZnCl2 amount on Chl, its protective action resulted to be more noticeable toward Chl a: at 150 ppm, an increased amount of about 2.5 and 1.5 times was found for Chl a and Chl b, respectively, in comparison to the reference (0 ppm ZnCl2). The EAE and the simultaneous use of two metal ions (zinc and copper) combined at a 10:1 ratio, was also tested in order to improve the pigment's stability keeping it inside intact chloroplasts. Optimized via RSM, this combined approach allowed us to increase the amount of recovered intact chloroplasts, improving Chl stability and preserving its green color. Applied to meringues, the pigment maintained the green color without affecting sensory qualities at lower concentrations (1-3% w/w). Finally, since Chl application is limited by its poor solubility and stability in aqueous solutions, especially under acidic conditions, a novel approach to enhance the solubility and stability of zinc modulated Chl (Chl-Zn2+) by complexation with whey protein isolate (WPI) and alginate (ALG) was investigated. Encapsulation of Chl-Zn2+ with WPI prevented its precipitation between pH 3 and pH 7, except at the isoelectric point (pI) of WPI (around pH 4.5). The visual appearance, colorimetric measurements, and absorbance spectra indicated that Chl-Zn2+ formed stable complexes with WPI at various pH. Additionally, the inclusion of ALG prevented isoelectric precipitation at pH 4.5, likely due to electrostatic interactions between WPI and ALG, leading to the formation of stable Chl-WPI-ALG complexes. These complexes significantly improved the color stability and solubility of Chl-Zn2+ during storage under both neutral and acidic conditions. Fluorescence spectroscopy and particle size measurements confirmed the formation of these complexes and their enhanced stability. Finally, this study suggests that the use of WPI and ALG to encapsulate Chl-Zn2+ could be an effective method to expand its application in acidic food products, providing a stable and vibrant natural colorant.
Lo spreco alimentare rappresenta un problema importante dal punto di vista economico e ambientale. Nell'ottica dell'Economia Circolare, lo spreco alimentare può essere una fonte eccellente per il recupero di molecole ad alto valore aggiunto, come i coloranti. Cavalcando l'onda della domanda in continua crescita di coloranti naturali recuperati con metodi green, l'obiettivo di questo progetto di tesi di Dottorato è sviluppare un protocollo su misura per l'estrazione, stabilizzazione e incapsulamento della clorofilla (Chl) dagli scarti vegetali, da utilizzare come colorante naturale per alimenti. È stato sviluppato un approccio personalizzato di Estrazione Assistita da Enzimi (EAE) per il recupero conservativo dei cloroplasti contenenti Chl da spinaci invenduti, garantendo la stabilità e la protezione del pigmento. Inoltre, poiché la Chl può subire una serie di reazioni che portano alla perdita del magnesio centrale, è stato valutato l'uso dello zinco come sostituto (in grado di ripristinare la sua stabilità). La matrice vegetale è stata caratterizzata in termini di composizione dei polisaccaridi della parete cellulare, ed è stata formulata una miscela enzimatica su misura basata su cellulasi (40%), xilanasi (41%) e poligalatturonasi (19%). Le variabili del processo [temperatura (°C), tempo (h), dosaggio della miscela enzimatica (U/g), concentrazione di ZnCl2 (ppm) e rapporto tampone/substrato (B/S)] e le loro interazioni sono state studiate tramite la Metodologia della Superficie di Risposta (RSM). L’overlay plot ha permesso di identificare le condizioni di processo (T: 25 °C, Zn: 150 ppm e B/S: 17,5, t: <2 h e dosaggio della miscela enzimatica tra 12 e 45 U/g) per massimizzare la quantità di Chl e, contemporaneamente, la qualità del colore verde dell'estratto. Il nuovo colorante è stato poi applicato nella produzione di un alimento reale (baghrir). Inoltre, la cinetica di estrazione della Chl e il rendimento di recupero sono stati ulteriormente studiati utilizzando un metodo senza solventi organici, basato su opzioni di dosaggio limitate (biocatalizzatore e ZnCl2) per il recupero rapido e delicato della Chl. La cinetica di estrazione del pigmento si è rivelata uno strumento molto utile per identificare le condizioni appropriate, in termini di dosaggio del biocatalizzatore (0,10–50 U/g), tempo di estrazione (1–48 h) e quantità di ZnCl2 (50–300 ppm), sia per migliorare la resa di estrazione che per preservare la tonalità di verde. Considerando la cinetica di estrazione, la resa di estrazione e i dati colorimetrici, le condizioni ottimali per produrre un colorante stabile, verde e adatto agli alimenti sono: 0,10 U/g di mix enzimatico, 3 h e 150 ppm di ZnCl2 a 25 °C. La resa di estrazione della Chl (4863μg/U) è stata circa il 51% maggiore rispetto al controllo, con una costante di estrazione più alta (5,43 × 10−4 g/(μg min)). Considerando l'impatto della quantità di ZnCl2 sulla Chl, la sua azione protettiva è risultata più evidente nei confronti della Chl a: a 150 ppm, è stata trovata una quantità aumentata di circa 2,5 e 1,5 volte per Chl a e Chl b, rispettivamente, rispetto al riferimento (0 ppm ZnCl2). L'EAE e l'uso simultaneo di due ioni metallici (zinco e rame) combinati in un rapporto 10:1 sono stati testati per migliorare la stabilità del pigmento
mantenendolo all'interno dei cloroplasti intatti. Ottimizzato tramite RSM, questo approccio combinato ha permesso di aumentare la quantità di cloroplasti intatti recuperati, migliorando la stabilità della Chl e preservando il suo colore verde. Applicato alle meringhe, il pigmento ha mantenuto il colore verde senza compromettere le qualità sensoriali a basse concentrazioni (1-3% p/p). Infine, poiché l'applicazione della Chl è limitata dalla sua scarsa solubilità e stabilità nelle soluzioni acquose, soprattutto in condizioni acide, è stato studiato un approccio innovativo per migliorare la solubilità e stabilità della clorofilla modulata dallo zinco (Chl-Zn2+) mediante complessazione con whey protein isolate (WPI) e alginato (ALG). L'incapsulamento della Chl-Zn2+ con WPI ha impedito la sua precipitazione tra pH 3 e pH 7, eccetto al punto isoelettrico (pI) di WPI (circa pH 4,5). L'aspetto visivo, le misurazioni colorimetriche e gli spettri di assorbimento hanno indicato che la Chl-Zn2+ ha formato complessi stabili con WPI a vari pH. Inoltre, l'inclusione di ALG ha prevenuto la precipitazione isoelettrica a pH 4,5, probabilmente a causa di interazioni elettrostatiche tra WPI e ALG, che hanno portato alla formazione di complessi stabili Chl-WPI-ALG. Questi complessi hanno significativamente migliorato la stabilità del colore e la solubilità della Chl-Zn2+ durante lo stoccaggio sia in condizioni neutre che acide. La spettroscopia di fluorescenza e le misurazioni delle dimensioni delle particelle hanno confermato la formazione di questi complessi e la loro maggiore stabilità. Infine, questo studio suggerisce che l'uso di WPI e ALG per incapsulare la Chl-Zn2+ potrebbe essere un metodo efficace per espandere la sua applicazione nei prodotti alimentari acidi, fornendo un colorante naturale stabile e vibrante.
Additional information
Dottorato di ricerca in Scienze delle Produzioni Vegetali e Animali
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