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Title: Validazione di un repertorio di anticorpi ricombinanti ad alta stabilità per studi di interferenza funzionale in pianta attraverso un approccio proteomico
Other Titles: Validation of a repertoire of highly stable recombinant antibodies for functional interference studies in plant using a proteomic approach
Authors: Di Carli, Mariasole
Keywords: Phage display;Anticorpo scFv;Intrabodies;Pianta transgenica;2D-Elettroforesi;Tecnologia DIGE;scFv fragment;Transgenic plant;2D-electrophoresis;DIGE technology;BIO/04
Issue Date: 10-Apr-2006
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 18. ciclo
Abstract: 
Gli anticorpi, oltre al loro importante ruolo fisiologico, sono uno strumento molecolare di grande valore applicativo. Pur tuttavia, poiché sono molecole di tipo secretorio, se vengono indirizzate in compartimenti cellulari diversi dalla via di secrezione, possono incorrere in problemi di stabilità e ripiegamento, che portano nella maggioranza dei casi, alla perdita di funzionalità della molecola e alla sua degradazione. Questo rappresenta un limite all’impiego degli anticorpi come molecole leganti (ad esempio in diagnostica o terapia) e come interferenti funzionali in studi di attività di molecole di interesse.
Il problema è stato affrontato preparando un repertorio di anticorpi (‘library F8’) costruito sulla struttura portante di un anticorpo ricombinante, chiamato scFvF8, in grado di mantenere la capacità di legame e di stabilità anche in ambiente citoplasmatico (Desiderio et al., 2001).
Nel corso di questo dottorato sono stati selezionati dal repertorio anticorpi diretti contro un virus vegetale (potato virus X), che si aggiungono ad altri già selezionati e caratterizzati in precedenza (scFvCMV-4G, scFvHEL-11E, scFvPVX-7F e scFvGST-5G). Tutti gli anticorpi ricombinanti a singola catena (scFv) selezionati dalla ‘library F8’ sono stati espressi nel compartimento periplasmatico e nel citoplasma di E. coli per valutare i livelli di espressione di proteina solubile e per la purificazione. Mediante analisi di risonanza plasmonica di superficie (tecnologia Biacore), sono state confrontate le costanti di affinità antigene-anticorpo, sia nella forma ossidata che nella forma ridotta di ciascun scFv selezionato. Le cinetiche di interazione di tutti i frammenti scFv nella forma ridotta sono risultate perfettamente paragonabili a quelle delle corrispondenti forme ossidate. Questo ha permesso di completare il quadro di caratterizzazione del repertorio e di dimostrare in modo inequivocabile che tutti gli anticorpi selezionati dalla ‘library F8’ sono in grado di ripiegarsi funzionalmente anche in assenza dei ponti disolfuro, confermando l’alta stabilità intrinseca di questo repertorio e la sua validità come fonte di anticorpi attivi nell’ambiente citoplasmatico.
Questi anticorpi possono, per esempio, essere utilizzati per interferire con specifiche funzioni proteiche correlate a condizioni fisio-patologiche. E’ stato dimostrato che l’espressione del scFvCMV-4G in piante di pomodoro è in grado di interferire con l’attività virale del patogeno CMV (cucumber mosaic virus) a livello citoplasmatico (Villani et al., 2005).
Il presente progetto di ricerca si è proposto di investigare la validità degli anticorpi selezionati dalla ‘library F8’ per la preparazione di piante resistenti a patogeni, attraverso un approccio proteomico. A questo scopo è stata impiegata una tecnologia di marcatura e analisi molecolare avanzata (sistema DIGE, Amersham Biosciences) che ha permesso di confrontare con alta affidabilità i ‘pattern’ proteici delle piante transgeniche resistenti all’infezione del CMV con le corrispondenti piante di pomodoro non geneticamente modificate. Lo scopo di tale analisi è stato quello di valutare eventuali differenze di espressione proteica inaspettate nel metabolismo della pianta.
I risultati ottenuti hanno permesso di stabilire che differenze di espressione statisticamente significative non sono evidenti, ad eccezione del frammento anticorpale scFv prodotto dal gene inserito. Questo studio (in attesa di essere confermato dall’analisi di spettrometria di massa) apre la prospettiva per investigare ulteriormente le eventuali differenze proteiche quali-quantitative che sono alla base della resistenza mediata dall’anticorpo. Inoltre, in una prospettiva applicativa, la dimostrazione dell’ ”equivalenza sostanziale”, alla base della normativa di regolamentazione degli OGM, anche a livello proteomico tra la pianta transgenica e il corrispettivo non trasformato potrebbe contribuire all’accettabilità della pianta resistente per usi commerciali.

The antibodies are able to recognize other molecules with high affinity. For this feature they represent an important molecular tool for many applications, from therapeutics and diagnostics research to many potential applications in functional proteomics. The principal limit in the antibodies use is represented by the difficulty to functionally express these naturally secreted proteins in cell cytoplasm. In fact, in this reducing environment, disulphide bonds cannot be formed and folding enzymes are absent, often leading to insoluble protein aggregates that are rapidly degradated by the cell. This represents a serious restriction for those applications that require the interaction with target molecules expressed in intracellular compartment. The problem has been undertaken by building a repertoire of recombinant antibodies, named ‘F8 library’, using the scaffold of a highly stable scFv antibody functionally expressed in cytoplasm cell.
This PhD project has regarded the selection from ‘F8 library’ of new antibodies against the plant virus PVX to increase the number of the scFv fragments already selected and characterized. All the recombinant antibodies isolated from ‘F8 library’ were expressed in both bacterial periplasm and cytoplasm and purified to assess their functionality in reducing conditions. These scFv antibodies were assayed by surface plasmon resonance (SPR) in both oxidised and reduced form. Comparable affinity constants between the oxidised and the reduced form was obtained for each scFv fragment. The results of this work definitively demonstrated that the scFv antibody fragments selectable from ‘F8 library’ are functional also in the absence of intra-domain disulphide bridges. Therefore, this repertoire can be used to isolate‘intrabodies’ with different specificities able to block, suppress, or alter processes mediated by intracellular target molecules. In particular, these antibodies can be used to alter the function of plant pathogens.
An example of functional interference in plant, mediated by a ‘library F8’ derived intrabody, was analysed, through proteomic approach. In this work DIGE technology (Amersham Bioscences) was used to compare, with high confidence, protein expression levels of transgenic tomato plants, expressing an anti –CMV (cucumber mosaic virus) antibody, with untransformed plants. The aim of this analysis was to evaluate the possibility of unexpected changes in the plant protein expression.
No statistically significant differences were detected, except of the fragment scFv (mass spectrometry is in progress to confirm these data), indicating that the expression of the major proteins was unmodified by the genetic manipulation.
This result opens new prospects to investigate either qualitative or quantitative protein differences in the virus resistance antibody mediated. Furthermore, the proteomic demonstration of the ‘substantial equivalence’ between transgenic plant and its unmodified correspondent could highly contribute to spread the acceptability of the transgenic plant as a safe food.
Description: 
Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetali
URI: http://hdl.handle.net/2067/98
Rights: If not otherwise stated, this document is distributed by the Tuscia University Open Archive under a Creative Commons 2.0 Attribution - Noncommercial - Noderivs License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.0/)
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