Impiego delle piante come biofabbriche ed uso di sequenze derivate da pianta e/o da virus vegetali per lo sviluppo di vaccini di nuova generazione (genetici e di origine vegetale) contro i tumori indotti dai virus del papilloma umano ad alto rischio.

Abstract

I Papillomavirus ad alto rischio (principalmente HPV16 e 18) sono gli agenti eziologici primari del cancro della cervice uterina. Esiste un’esigenza reale di sviluppare vaccini terapeutici che impediscano la progressione o eradichino le lesioni neoplastiche HPV-correlate. L’oncoproteina E7 di HPV16 è un’antigene tumore-specifico implicato nella progressione maligna ed è il bersaglio principale per lo sviluppo di una terapia selettiva anti-cancro. La vaccinazione genetica rappresenta un approccio interessante per lo sviluppo di terapie vaccinali anti-HPV e sequenze derivate da pianta e da virus vegetali possono offrire nuove opportunità nello sviluppo di tali strategie. Abbiamo deciso di utilizzare il gene della proteina di rivestimento del virus X della patata (PVX-CP) per incrementare la scarsa immunogenicità del gene E7, viste le proprietà auto-assemblanti di tale proteina (in grado di indurre risposte immuni di tipo CD4+), e rappresentando essa un antigene primario per l’uomo. Abbiamo, per ragioni di sicurezza, introdotto tre mutazioni puntiformi nel sito di legame alla proteina del retinoblastoma (pRb) del gene E7 di HPV16 al fine di abolirne il potenziale oncogeno (gene “E7GGG”). Sono state poi realizzate le fusioni geniche del gene PVX-CP all’estremità 3’ del gene E7GGG. I geni ottenuti sono stati clonati in un vettore d’espressione di mammifero per l’uso in un modello pre-clinico di immunizzazione terapeutica. La somministrazione i.m. del vaccino genetico, basato sulla fusione del gene E7GGG con la sequenza PVX-CP in topi C57BL/6, è stata in grado di indurre una risposta immune sia di tipo umorale sia di tipo cellulo-mediato ed ha in molti casi prevenuto, negli altri casi ritardato, lo sviluppo del tumore dopo sfida con cellule tumorigeniche esprimenti la proteina E7. Al fine di migliorare la visibilità della proteina E7 al sistema immune, è stato realizzato un costrutto secretorio basato sulla fusione della sequenza segnale della proteina inibente la poligalatturonasi (PGIPss) di Phaseolus vulgaris a monte del gene E7 a sua volta fuso o meno alla sequenza PVX-CP. Il vaccino basato sulle fusioni con PGIPss ha dimostrato di conferire una consistente risposta immune di tipo umorale e una parziale protezione dallo sviluppo di tumore in un modello di vaccinazione pre-clinica. In conclusione, le fusioni del gene E7GGG con il gene PVX-CP o con la sequenza PGIPss di Phaseolus vulgaris hanno dimostrato di poter determinare un incremento delle risposte immuni umorali e linfocitarie E7-specifiche indotte dall’immunizzazione con il solo gene E7GGG. Sequenze mutuate dal mondo vegetale possono rappresentare effettivamente una strategia alternativa per il miglioramento dell’efficacia dei vaccini genetici volti alla terapia dei tumori correlati ad HPV. Le biotecnologie vegetali sono state utilizzate negli ultimi anni per la produzione di antigeni vaccinali attraverso sistemi che consentono l’espressione stabile o transiente della proteina eterologa. In questo lavoro abbiamo anche ottenuto l’espressione della proteina E7 di HPV16, mediata da un vettore d’espressione derivato dal virus X della patata (PVX), nella via secretoria e nell’apoplasto di Nicotiana benthamiana utilizzando la sequenza segnale derivata da pianta PGIPss (costrutto pPVX-PGIPss-E7). Tale strategia ha permesso di ottenere un incremento dell’espressione della proteina E7, rispetto a quella citoplasmatica pari a cinque volte (Franconi et al., in press). I topi immunizzati con l’estratto di pianta contenente una dose maggiore di proteina E7 (derivato dalle piante infettate con pPVX-PGIPss-E7) hanno mostrato un incremento della risposta immune ed una protezione più efficace contro lo sviluppo del tumore dopo quattro immunizzazioni a seguito di sfida con cellule tumorigeniche esprimenti E7. Infatti, nell’80% degli animali vaccinati il tumore non si è sviluppato e nel restante 20% è risultato di taglia notevolmente inferiore rispetto ai controlli (Franconi et al., in press). I risultati ottenuti consentono di affermare che l’indirizzamento della proteina E7 nella via di secrezione permette di incrementare la produzione di tale antigene in pianta e di migliorare l’efficacia immunoterapeutica degli estratti vegetali che lo contengono. In questo lavoro è stato anche dimostrato che, fusioni delle proteine E7 ed E7GGG all’enzima lichenasi B (â-glucanasi) di Clostridium thermocellum ed il “targeting” al reticolo endoplasmatico in costrutti per l’agro-infiltrazione, hanno migliorato di circa dieci volte i livelli di espressione delle proteine E7 ed E7GGG in Nicotiana benthamiana rispetto all’espressione transiente mediata da pPVX-PGIPss-E7 incrementando, di conseguenza, il contenuto di proteina E7 utilizzabile per dose di vaccino. Di conseguenza, è stato possibile ottenere elevate rese all’atto della purificazione mediante cromatografia per affinità e a scambio ionico. Tali costrutti sono attualmente in studio in un modello pre-clinico. L’uso dell’enzima lichenasi come reporter traduzionale, renderà più semplice l’analisi dei livelli di espressione delle proteine chimeriche contenenti le proteine E7 e E7GGG in radici ottenute a partire da espianti fogliari di Petunia hybrida e di Nicotiana benthamiana trasformati stabilmente da Agrobacterium rhizogenes ricombinanti. La selezione dei cloni che ne esprimono i livelli migliori servirà all’allestimento di colture d’organo ai fini della produzione di estratti, di liofilizzati oppure per la purificazione dei prodotti di interesse ai fini della vaccinazione in un modello pre-clinico.

The high-risk types of the Human Papilloma Virus (mostly HPV16 and 18) are the primary etiologic agents of invasive cervical cancer. A real need exists to develop therapeutic vaccines able to hinder the progression and to eliminate malignant tumors. The HPV16 E7 oncoprotein is a tumor-specific antigen central to malignant progression and it represents a prime target for the development of selective anti-cancer DNA vaccination. In this context, plant- and plant virus-derived sequences offer new opportunities to activate immunity against HPV epitopes to attack cervical cancer. Being a primary antigen in humans and having the ability to self-assemble in structures able to increase the CD4+ immune response, we chose the PVX coat protein (PVX-CP) as an alternative gene to be fused with the E7sequence, in order to overcome the poor immunogenicity of the E7 protein. Because of safety concerns, we introduced three point mutations into the retinoblastoma (pRb)-binding site of HPV16 E7 oncogene to abolish its transformation potential (“E7GGG” gene). Then, we made downstream gene fusions of the E7GGG gene with the PVX-CP sequence. The genes were cloned into a mammalian expression plasmid and used to characterize expression features and to inoculate mice in an experimental therapeutic vaccination. Here we show that the E7GGG-CP fusion DNA vaccines, administered i.m. to C57BL/6 mice, induced both humoral and cell-mediated immune response. Besides, vaccinated mice that were challenged with a tumorigenic dose of E7-expressing cells were protected from either establishment or progression of cancer. In order to improve the E7 protein “visibility” by the immune system, a secretory construct of the E7GGG gene was made by N-terminal gene fusion with the signal peptide coding sequence of the polygalacturonase inhibiting protein (PGIPss) from bean. Then, the E7GGG sequence was assembled with PGIPss sequence alone or with a C-terminal PVX-CP sequence. The E7GGG-fusion DNA vaccines administered i.m. to mice induced a remarkable humoral immune response and vaccinated mice challenged with a tumorigenic dose of E7-expressing cells were partially protected from establishment of cancer. In conclusion, fusion with the plant viral gene PVX-CP and the PGIPss sequence from Phaseolus vulgaris can enhance the humoral and E7-specific lymphocytes response induced by E7 genetic immunization and may represent an alternative strategy to improve efficacy of genetic vaccines targeting cervical carcinoma antigens. Plants have emerged as an alternative for the production of effective ‘second generation’ vaccines. Here we report the transient expression, mediated by a PVX-derived vector, of the E7 protein targeted to the secretory system of Nicotiana benthamiana plants by using the plant-derived signal sequence PGIPss from bean. Targeting the antigen to the secretory pathway enhanced the E7 protein expression levels about five-fold with respect to cytoplasmic expression. Mice immunized by s.c. administration with crude foliar extracts containing E7 showed strong stimulation of cell-mediated immune response after four boosters. After challenging with the E7-expressing C3 tumor cells, tumor growth was completely inhibited in 80% of the vaccinated animals and a drastic reduction of tumor burden was observed in the remaining tumor-affected mice (Franconi et al., in press). These data demonstrate that, by enhancing E7 yield, it is possible to improve the anti-cancer activity of the plant-based experimental vaccine and open the way for a large-scale production of the E7 protein which could be used as ‘in planta’ formulation. Here we show also that fusion of the E7 or E7GGG proteins with Clostridium thermocellum lichenase B (â-glucanase) and the endoplasmic reticulum targeting signal, improved about 10 fold E7 protein yield in an agro-infection-mediated transient expression system with respect to the PVX-mediated transient expression in crude Nicotiana benthamiana extracts and, therefore, the protein content/immunization dose. As a result, high purification yields were obtained as well, by affinity and ion-exchange chromatography. The purified Lic-E7-KDEL and Lic-E7GGG-KDEL fusion proteins are currently being tested in a therapeutic immunization schedule in a pre-clinical model. The presence of lichenase of Clostridium thermocellum in the E7 hybrid proteins will be exploited to facilitate the analysis and the selection of clonal roots obtained from stable transformation of leaf explants from Petunia hybrida and of Nicotiana benthamiana with recombinant Agrobacterium rhizogenes. Organ coltures will be eventually obtained in order to produce extracts, lyophilized material or purified fusion proteins to be tested in a pre-clinical vaccination model.