Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/91
Title: Il fattore di rimodellamento della cromatina BRM ha un ruolo specifico nel corso del differenziamento muscolare
Other Titles: The BRM chromatin-remodeling factor plays a specific role during muscle differentiantion
Authors: Albini, Sonia
Keywords: Cromatina;Miogenesi;Chromatin;Myogenesis
Issue Date: 4-Apr-2006
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 18 Ciclo.
Abstract: 
Il differenziamento miogenico è realizzato dai fattori regolatori miogenici tra cui il piu' importante è MyoD. In seguito a stimoli differenziativi, MyoD viene attivata e induce da un lato la trascrizione dei geni inibitori della proliferazione e, dall'altro, la trascrizione dei geni muscolo-specifici. Studi recenti hanno messo in luce che i complessi di rimodellamento della cromatina SWI/SNF coadiuvano l'attività trascrizionale di MyoD. All'interno di questi complessi multiproteici esistono, in cellule di mammifero, due subunità dotate di attività ATPasica: Brm e BRG1. Queste proteine sono presenti nei complessi SWI/SNF in maniera mutualmente esclusiva indicando che nelle cellule coesistono due tipi di complessi di rimodellamento, quello contenente Brm e quello contenente BRG1.
Per studiare il ruolo specifico di questi due tipi di complessi nella miogenesi, abbiamo analizzato l'espressione di Brm e BRG1 nel corso del differenziamento dei mioblasti della linea C2. I nostri dati indicano che i livelli dell'mRNA e della proteina di Brm sono specificamente e progressivamente indotti, mentre quelli di BRG1 rimangono pressoché costanti, suggerendo un ruolo specifico di Brm durante il differenziamento muscolare. In accordo con questa ipotesi è l'osservazione che versioni dominanti negative di Brm che portano mutazioni in regioni funzionali cruciali della proteina, inibiscono gravemente la capacità transattivante di MyoD. Ciò indica che per l'induzione dei geni muscolo-specifici è richiesta la presenza di complessi SWI/SNF funzionalmente attivi. Questo approccio non permette però di distinguere le funzioni dei due tipi di complessi; infatti, poiché i complessi SWI/SNF condividono diverse subunità, l'introduzione di Brm (wild-type o mutante) può intaccare l'abilità di formare complessi funzionali anche di BRG1.
Per investigare la richiesta specifica di Brm nella miogenesi, abbiamo esaminato il differenziamento muscolare mediato dall'espressione ectopica di MyoD, in fibroblasti primari embrionali derivati da topi con genotipo BRM-/- rispetto alla loro controparte wild-type BRM +/+. I nostri risultati indicano che MyoD induce livelli d'espressione notevolmente ridotti dei marcatori muscolari della fase tardiva in cellule BRM-/-, mentre l'assenza di BRM non sembra compromettere la capacità di MyoD di indurre l'arresto del ciclo cellulare.
Per accertarsi che i difetti di differenziamento osservati nelle cellule BRM-/- fossero dovuti realmente all'assenza di BRM e non ad altre eventuali mutazioni, abbiamo riespresso BRM in queste cellule attraverso un'infezione virale. Sia una popolazione mista, sia cloni indipendenti esprimenti BRM ectopico, sono stati poi infettati con un retrovirus codificante per MyoD e analizzati per la loro capacità differenziativa.
I risultati indicano che la reintroduzione di BRM ripristina l'espressione dei marcatori muscolari, confermando che Brm è realmente necessaria per l'attivazione trascrizionale di tali geni e suggeriscono l'ipotesi che Brm possa essere reclutata sui promotori muscolo-specifici partecipando così alla loro attivazione. Per verificare tale ipotesi, abbiamo condotto esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina sui cloni esprimenti stabilmente BRM e sul clone di controllo senza BRM, indotti a differenziare dopo espressione ectopica di MyoD. I nostri risultati indicano che Brm è reclutata su regioni regolatorie trascrizionalmente attive dei geni muscolari insieme a MyoD, MEF2C, p300 e P/CAF nei cloni BRM+/+, mentre nel clone BRM -/- questi fattori non sembrano avere accesso sui loci muscolari.
Questi dati suggeriscono che Brm è richiesta per la formazione di un complesso trascrizionalmente attivo sui promotori muscolari e solleva la questione di come la proteina sia indirizzata sui promotori specifici.
Allo scopo di capire il meccanismo tramite cui Brm sia specificamente reclutata sui loci muscolari, abbiamo analizzato la capacità di Brm e BRG1 di interagire con i fattori miogenici bHLH e MEF2. I nostri risultati hanno messo in evidenza un'interazione specifica e preferenziale di Brm con MEF2C, mentre non abbiamo riscontrato alcuna interazione con MyoD o miogenina nelle condizioni da noi utilizzate.
Questi dati, nel loro insieme, suggeriscono che MEF2C potrebbe essere il fattore di trascrizione che recluta Brm sui promotori muscolo-specifici.
La similarità del fenotipo differenziativo difettivo osservato nelle cellule BRM-/- e nelle cellule RB-/- ci ha suggerito l'ipotesi che Brm ed pRb potessero far parte di uno stesso percorso regolativo nel corso del differenziamento tardivo. Questa ipotesi è stata rafforzata da recenti evidenze secondo le quali l'espressione di Brm è regolata negativamente da ras e l'espressione di ras è regolata negativamente da pRb, suggerendo un meccanismo indiretto nella regolazione dell'espressione di Brm da parte di pRb. I nostri dati indicano che in cellule miogeniche RB-/- in cui sia stata ripristinata l'espressione di pRB, i livelli di mRNA di Brm, ma non quelli di BRG1, aumentano notevolmente in cellule differenziate insieme a quelli dei marcatori tardivi del differenziamento. Questi ultimi risultati rivelano che l'induzione di Brm da parte di pRb è una componente del meccanismo tramite cui pRb promuove la fase tardiva del differenziamento muscolare.

Myogenic differentiation is achieved by myogenic bHLH regulatory factors, whose prototype is MyoD, which act in cooperation with the MEF2 family of transcription factors. Upon differentiation signals, MyoD is activated and induces the transcription of muscle-specific genes as well as that of genes involved in cell cycle arrest. Recent studies revealed the requirement of SWI/SNF chromatin-remodelling complexes in MyoD-induced myogenesis. Within the SWI/SNF complexes, Brm and BRG1 are mutually exclusive subunits and harbour the ATPase activity, indicating that two versions of the SWI/SNF complex, associated with either the BRG1 or the BRM ATP-ase subunit, coexist in mammalian cells.
To start investigating the specific role of SWI/SNF complexes (BRG1- or BRM-containing) in muscle differentiation, we analysed the expression of BRM and BRG1 in growing versus differentiating C2 myoblasts. Our data indicate that the levels of Brm mRNA and protein are considerably induced, whereas those of BRG1 remain relatively constant, suggesting that BRM might play a specific role during muscle differentiation. According to this hypothesis is our observation that the expression of dominant negative versions of Brm, carrying mutations in crucial regions of the protein, severely inhibit the ability of MyoD to activate muscle-specific genes. These data while clearly indicating that functional SWI/SNF complexes are required for muscle gene transcription, do not allow distinguishing the specific functions of BRG1 and BRM. In fact, because both BRG1- and BRM-based SWI/SNF complexes share many of the same subunits, introduction of BRM (wt or mutant) may deleteriously affect also the ability of BRG1 to form functional complexes.
To investigate the specific requirement of BRM, we examined MyoD-mediated induction of muscle differentiation in primary embryo fibroblasts derived from BRM -/- mice as compared to their WT counterpart. The results of such analysis indicate that MyoD induces greatly reduced levels of several differentiation markers in cells lacking BRM. By contrast, the absence of BRM does not appear to affect the ability of MyoD to induce cell cycle arrest.
To ascertain that the differentiation defects observed in BRM-deficient cells were truly due to the absence of BRM, and not to additional mutations necessary for proliferation in culture, we re-expressed BRM in these cells by means of retroviral infection. Both a pooled population and independent clones expressing ectopic BRM were then infected with a MyoD-encoding retrovirus, and analyzed for their ability to differentiate. Our results indicate that the re-introduction of BRM in BRM-deficient cells is sufficient to restore normal expression levels of muscle differentiation markers. To establish whether Brm is recruited on muscle gene promoters, we performed experiments of chromatin immunoprecipitation in stable clones expressing Brm as compared to the control cells lacking Brm, after induction of muscle differentiation by ectopic MyoD. Our results indicate that Brm is recruited on muscle promoters together with MyoD, MEF2C, p300 and P/CAF in the BRM +/+ clone, while these factors do not appear to gain access on muscle loci in BRM -/- cells. These data suggest that Brm is required to build a MyoD-transcriptionally active complex on muscle regulatory regions and rise the question of how Brm is targeted on muscle-specific promoters. To address this issue we analysed the ability of Brm and BRG1 to interact with myogenic bHLH and MEF2 transcription factors. Our results highlighted a specific and selective interaction between Brm and MEF2C, while in our experimental conditions we did not find any interaction between Brm and Myod or myogenin. Taken together these data suggest that MEF2C may be the transcription factor implied in the recruitment of Brm on muscle-specific promoters.
The defective differentiation phenotype observed in BRM -/- overlaps that observed previously in Rb -/- cells, suggesting that Brm and Rb could be part of the same pathway during the late phase of muscle differentiation. This hypothesis was supported by recent evidences according to which Brm expression is negatively affected by ras and ras expression is negatively regulated by pRb, suggesting an indirect mechanism by which Rb could affect the expression of Brm. Our data indicate that in Rb -/- myogenic cells in which we reintroduced Rb expression, the levels of Brm mRNA, but not BRG1, are greatly enhanced together with those of late markers of differentiation. These results reveal that the Rb-mediated induction of Brm may be a novel mechanism by which Rb promotes terminal differentiation.
Description: 
Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare
URI: http://hdl.handle.net/2067/91
Rights: If not otherwise stated, this document is distributed by the Tuscia University Open Archive under a Creative Commons 2.0 Attribution - Noncommercial - Noderivs License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.0/)
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