Studio dell'effetto dei probiotici sulla modulazione della risposta immunitaria intestinale

Abstract

Il sistema immunitario intestinale è in grado di proteggere la mucosa contro i patogeni, ma deve anche evitare reazioni di ipersensibilità contro proteine alimentari, la normale flora batterica ed altre molecole ambientali. La tolleranza orale è la soppressione specifica della risposta immunitaria cellulare ed umorale verso un particolare antigene introdotto con gli alimenti o verso la microflora locale, evitando così reazioni immunitarie indesiderate. Si ritiene che la rottura della tolleranza orale può portare allo sviluppo di patologie immunitarie della mucosa causate da reazioni contro antigeni alimentari o ambientali e addirittura contro autoantigeni con conseguente comparsa di malattie autoimmuni. Un numero sempre crescente di studi ha messo in evidenza che i batteri probiotici sono in grado di svolgere effetti benefici sulla salute, grazie alle svariate proprietà da loro esercitate, quali: il mantenimento di un giusto equilibrio nella microflora intestinale, la protezione contro patogeni intestinali e la modulazione della risposta immunitaria che sembra portare ad un miglioramento nelle allergie alimentari, disturbi autoimmuni e tolleranza orale. A tutt'oggi non sono ancora chiari i meccanismi di azione dei probiotici nella risposta immunitaria intestinale. In questo studio si è voluto verificare se la somministrazione orale di probiotici potesse indurre una risposta anti-infiammatoria e tollerogenica a livello intestinale. A questo scopo sono stati utilizzati due modelli sperimentali: ratti resi tolleranti verso l'antigene alimentare ovalbumina (OVA), normalmente non presente nella loro dieta, e ratti immunizzati con lo stesso antigene. I probiotici utilizzati sono stati Bifidobacterium animalis MB5 (Ba), un ceppo relativamente nuovo di cui non sono stati studiati i potenziali effetti benefici, e Lactobacillus casei subsp. rhamnosus GG (LGG), un probiotico di cui sono note dalla letteratura molte attività vantaggiose. E' stata analizzata la proliferazione linfocitaria in risposta all'OVA o ad un mitogeno policlonale, la Concanavalina A (ConA), e la risposta di ipersensibilità di tipo ritardato (DTH). Sono stati valutati i livelli di espressione genica delle principali citochine coinvolte nell'induzione della tolleranza orale e di alcune citochine pro-infiammatorie. Inoltre sono state analizzate le principali sottopopolazioni linfocitarie a livello intestinale. I nostri risultati hanno evidenziato una diminuzione di proliferazione in risposta all'OVA nei linfociti mesenterici dei ratti immunizzati trattati con probiotici che si verificava solo a livello intestinale, in quanto la risposta proliferativa a livello splenico non veniva modificata e perché il trattamento con Ba ed LGG non influenzava la risposta DTH che risultava infatti ugualmente elevata nei tre gruppi di ratti immunizzati. La risposta proliferativa verso il mitogeno policlonale ConA risultava elevata ed uguale in tutti i gruppi di ratti analizzati ad indicare che l'osservata riduzione della proliferazione linfocitaria a livello mesenterico è antigene specifica. Il trattamento con LGG induce un aumento dell'espressione di interleuchina (IL)-10 ed un aumento della secrezione basale di IL-10 nei linfociti mesenterici dei ratti immunizzati e porta la sottopopolazione regolatoria di linfociti mesenterici CD4+-CD25+ verso un livello intermedio tra quello presente nei ratti di controllo tolleranti e quelli immunizzati. L'espressione genica di IL-4 e transforming growth factor (TGF)-β non veniva influenzata dal trattamento con i probiotici, mentre quella di interferon (IFN)-γ e cytokine induced neutrophil chemoattractant (CINC) veniva notevolmente ridotta nei linfociti splenici dei ratti immunizzati trattati con Ba o con LGG. In conclusione, il nostro studio ha messo in evidenza un nuovo ruolo svolto dai probiotici quali induttori di uno stimolo tollerogenico a livello intestinale, contribuendo a chiarire i meccanismi con cui alcuni probiotici possono esplicare la loro attività immunomodulatoria. E' possibile che LGG esplichi la sua funzione tollerogenica mediante induzione in vivo di una popolazione di cellule simili a Tr1, che hanno una ridotta capacità di proliferazione antigene specifica e una elevata capacità di produrre IL-10. Inoltre Ba e LGG sono in grado di modulare la risposta infiammatoria anche a livello splenico, riducendo l'espressione genica delle citochine pro-infiammatorie.

The gut immune system has to be able to protect the mucosa against pathogens but also must avoid hypersensitivity reactions to food proteins, normal bacterial flora and other environmental macromolecules. Oral tolerance is a specific suppression of cellular and humoral cell-mediated immune responses to orally administered antigen or to local microflora to prevent immune reactions to dietary antigens. Breakdown of oral tolerance may lead to the development of adverse reactions to food, mucosal immunopathologies directed against environmental antigens or autoantigens and thus to autoimmune disease. A large number of studies suggested that probiotics are able to exert numerous beneficial effects such as: mantenance of a balanced indigenous microflora, protection against intestinal pathogens and modulation of immune response that seem to ameliorate food allergies, autoimmune diseases and oral tolerance. Up to now, the mechanisms by which probiotics modulate intestinal immune response are not yet clarified. In this study, it was verified whether oral feeding with probiotics may induce an anti-inflammatory and tolerogenic response at intestinal site. For such pourpose, two experimental models were used: rats tolerant to the feed antigen ovalbumin (OVA), normally not present in their diet, and rats immunized for the same antigen. The probiotics used were Bifidobacterium animalis MB5 (Ba), a strain not widely studied, and Lactobacillus casei subsp. rhamnosus GG (LGG), a well known probiotic strain, with numerous beneficial effects. Proliferation of splenic and mesenteric lymphocytes after in vitro stimulation with OVA or with a polyclonal mitogen, Concanavalin A (ConA), and the delayed time hypersensitivity (DTH) reaction were assayed. Expression of cytokines involved in oral tolerance induction and of some pro-inflammatory cytokines was also evaluated. Moreover, the principal subpopulations of intestinal lymphocytes were analized. The results indicate that proliferation of mesenteric lymphocytes of immunized rats after in vitro stimulation with OVA was lower in probiotics fed animals than in unfed rats. Probiotics exert this effect only at intestinal level, in fact the proliferative response at splenic level and DTH response were not modified by probiotic treatment. The proliferative response after in vitro stimolation with the polyclonal mitogen ConA was high and similar in all groups of animals, suggesting that the reduction of proliferative response observed at intestinal level is antigen specific. LGG treatment induced an increase of interleukin (IL)-10 gene expression and an increase of basal secretion of IL-10 in mesenteric lymphocytes of immunized rats, compared to untreated rats. With LGG treatment, the regulatory subpopulation CD4+-CD25+ of intestinal lymphocytes reaches a middle level between the levels of tolerized and immunized rats. The gene expression of IL-4 and transforming growth factor (TGF)-β was not influenced by probiotic treatment, whereas gene expression of interferon (IFN)-γ and cytokine induced neutrophil chemoattractant (CINC) was reduced in splenic lymphocytes of immunized rats treated with Ba or LGG. The conclusions of this study highlight a new role for probiotics in inducing a tolerogenic response at intestinal level, and contribute to clarify the mechanisms by which some probiotics can exert their immunomodulatory activities. It is possible that LGG exerts its tolerogenic activity throught in vivo induction of a Tr1-like lymphocytes population, with a low antigen specific proliferative response and high IL-10 production. Moreover Ba and LGG are able to modulate inflammatory response at splenic level, reducing the gene expression of pro-inflammatory cytokines.