Meccanismi coinvolti nell'effetto prp-apoptotico dell'acido docosaesaenoico (DHA) nelle linea cellulare di adenocarcinoma pancreatico umano PaCa-44

Abstract

Gli acidi grassi poliinsaturi (PUFAs) sembrano avere effetti anti-proliferativi e proapoptotici in una ampia gamma di cellule tumorali anche se i meccanismi attraverso cui si esplica tale azione non sono ancora del tutto chiariti. In questo lavoro è stato studiato sia l’effetto pro-apoptotico dell’acido grasso poliinsaturo docosaesaenoico (DHA, C22:6 n-3) sia i meccanismi da esso mediati, utilizzando come modello sperimentale la linea cellulare di adenocarcinoma pancreatico umano PaCa-44. Trattamenti con acido butirrico (BA, C4:0), acido oleico (OA, C18:1), acido linoleico (LA, C18:2 n-6) e DHA alla concentrazione di 200 µM hanno evidenziato che tutti gli acidi grassi inibiscono la proliferazione, mentre solo il DHA ha indotto il processo apoptotico nella linea tumorale studiata. Sono stati quindi analizzati i meccanismi che mediano l’effetto pro-apoptotico del DHA. Utilizzando il probe DCFH-DA ed il saggio TBARs, sono stati evidenziati rispettivamente elevati livelli di ROS intracellulari e un incremento nella perossidazione lipidica (MDA) dopo trattamento con l’acido grasso. Inoltre alcuni composti antiossidanti come BHT, α-tocoferolo (Vitamina E) ed acido ascorbico (Vitamina C) hanno annullato l’effetto del DHA inibendo sia l’apoptosi sia la perossidazione lipidica. Questi dati hanno dimostrato che il processo di stress ossidativo è implicato nell’effetto pro-apoptotico mediato dal DHA. Nella morte cellulare indotta dall’acido grasso sembra inoltre essere coinvolta la molecola antiossidante glutatione (GSH), il quale, a seguito di trattamenti con l’acido grasso, viene trasportato all’esterno della cellula in forma ridotta. A riprova di questa osservazione l’uso di inibitori specifici dei trasportatori per GSH (metionina e cistationina) annulla l’effetto del DHA inibendo sia l’apoptosi sia la reazione di perossidazione lipidica. Il decremento di GSH intracellulare diminuisce l’attività dell’enzima glutatione perossidasi (GPx), GSH- e selenio-dipendente. L’aggiunta di selenio al medium di coltura ha inibito non solo l’apoptosi, ma anche la disattivazione dell’enzima GPx, la perdita di GSH e la perossidazione lipidica, rendendo evidente il coinvolgimento di GPx nell’apoptosi DHA-indotta. E’ stata infine investigata la possibilità che il DHA potesse modulare geneticamente il programma apoptotico agendo attraverso l’attivazione dei recettori nucleari Peroxisome Proliferator– Activated Receptors (PPARs). Cotrattamenti con DHA, Vitamina A (all-trans Retinoic Acid, at-RA) e Badge, (Bhisphenol A Diglycidyl Ether) inibitore dell’isoforma PPAR-γ, hanno evidenziato il coinvolgimento dei PPARs nell’apoptosi DHA-indotta. La regolazione dell’apoptosi da parte di tali recettori nucleari, sembra essere legata alla modulazione di geni che codificano per gli enzimi lipossigenasi (LOXs). A seguito di trattamento con DHA, infatti, l’espressione di tali enzimi viene modulata a seconda che essi svolgano rispettivamente funzioni anti-apoptotiche o pro-apoptotiche. Questi dati quindi evidenziano che il DHA manifesta un effetto antiproliferativo e pro-apoptotico sulla linea cellulare presa in esame attraverso due meccanismi, uno ossidativo e l’altro genetico, ugualmente coinvolti nel processo di morte mediato dal DHA.

Polyunsaturated fatty acids have been indicated to induce anti-proliferative and/or apoptotic effects in various tumor cells, although the mechanisms is unknown. In order to investigate the ability of fatty acids to induce growth inhibition and apoptosis in the human PaCa-44 pancreatic cancer cell line, alpha-linoleic acid (18:2, n-6; LA), butyric acid, oleic acid and docosahexaenoic acid (DHA) were supplemented at 200 µM concentration in the medium of cell cultures. Ours results showed that all fatty acids inhibited cell growth, while only DHA induced apoptosis in PaCa-44 cell line. Investigating the mechanism underlying DHA induced apoptosis, an oxidative process was implicated, considering that butylated hydroxytoluene (BHT), ascorbic acid (Vitamin C) and Vitamin E prevent lipid peroxidation and reversed apoptosis. Furthermore we showed that DHA induced intracellular depletion of reduced glutathione (GSH), without affecting oxidized glutathione (GSSG). Intracellular GSH depletion is reversed by metionine and cystathionine, two specificic inhibitors of carrier-mediated GSH extrusion, inhibition of GSH efflux completely reversed apoptosis and lipid peroxidation. Depletion of intracellular GSH level sensitizes cells to oxidative damage, decreasing activity of selenium-dependent glutathione peroxidase (GSH-Px) enzyme. Pretreatment with sodium selenate was accompanied by an increased level of GSH-Px activity, decreased of lipid peroxidation, GSH depletion and completely reversed apoptosis. These results provide the first evidence for a possible causative role of oxidative stress in DHA-induced apoptosis. Furthermore we investigated the implication of genetic mechanisms in apoptosis DHA-induced through activation of nuclear receptors Peroxisome Proliferator –Activated Receptors (PPARs). Treatments with Vitamin A (all-trans Retinoic Acid, at-RA) and Badge (Bhisphenol A Diglycidyl Ether), inhibitor of PPAR-γ, indicate that PPARs may be involved in DHA-induced apoptosis. The regulation of apoptosis through PPARs may be connected to modulation of lipoxygenases enzymes (LOXs). Indeed, PCR analysis demonstrated that treatment with DHA induced increased and/or decreased level of LOXs mRNA. These results document the antiproliferative and pro-apoptotic activities of DHA and suggest the interplay of two mechanisms, oxidative and genetic regulation, in DHA-induced apoptosis.