Ruolo biologico dell' ormone lattogeno placentare nel differenziamento della cellula beta pancreatica

Abstract

Il Diabete Mellito è una delle patologie più diffuse nella società occidentale e nei paesi industrializzati e si manifesta con un’alterata secrezione di insulina da parte delle cellule beta del pancreas con conseguente iperglicemia. Ad oggi l’unica terapia per la cura del diabete è la somministrazione di insulina e/o analoghi ed in ultima istanza il trapianto d’organo. A riguardo sono stati sviluppati differenti protocolli per il trapianto di pancreas, come ad esempio sembra che il trapianto combinato pancreas-rene produca una migliore aspettativa di vita. Attualmente è in corso di sviluppo la tecnica di trapianto di isole del Langherans in sostituzione al trapianto d’organo/i, rispetto al quale ha il vantaggio di essere meno invasivo e quindi più idoneo per l’applicazione nei bambini. Tuttavia il trapianto d’organo e di isole pancreatiche è limitato a causa di una scarsa disponibilità di donatori. Per ovviare a questa problematica di approvvigionamento in molti laboratori di ricerca sono in corso studi per ottenere cellule beta pancreatiche dal differenziamento di cellule staminali embrionali, da cellule staminali derivanti dal midollo osseo, o di cellule staminali pancreatiche duttali; dal dedifferenziamento e transdifferenziamento di tipi cellulari diversi. E’ stato dimostrato che le cellule beta pancreatiche possono proliferare in seguito a numerosi stimoli fisiologici e patofisiologici. Un gran numero di fattori di crescita hanno mostrato aumentare la proliferazione delle cellule beta, la massa e la loro funzione. Tra i fattori di crescita sono importanti l’ormone lattogeno placentare (PL), l’ormone della crescita (GH) e la prolattina (PRL), che appartengono ad una famiglia di ormoni polipeptidici omologhi e comuni a differenti specie dai primati ai pesci teleostei. PL è prodotto dalla placenta esclusivamente durante la gravidanza ed è il fattore principalmente responsabile dell’incremento della massa delle isole pancreatiche e della loro funzione. PL esercita una maggiore attività mitogena sulle cellule beta pancreatiche rispetto GH e PRL, quindi, potrebbe avere un potenziale ruolo nella sopravvivenza e funzione delle isole prima e/o dopo il trapianto. Il nostro interesse si è rivolto al possibile ruolo biologico dell’ormone hPL-A nel differenziamento cellulare. Lo scopo della presente tesi di dottorato è stato quello di ottimizzare una metodica di espressione e purificazione dell’ormone lattogeno placentare umano (isoforma A) (hPL-A), non reperibile commercialmente, fisiologicamente attivo, che possa essere utilizzato nello studio del possibile ruolo esercitato da hPL-A nel differenziamento di cellule del dotto pancreatico in cellule beta e analizzare il meccanimo molecolare di trasduzione del segnale. In questo studio come modello cellulare è stata utilizzata la linea cellulare PANC-1 (adenocarcinoma umano del dotto pancreatico). Le cellule siero deprivate sono state stimolate con 500 ng/ml di proteina ricombinante per 96 ore, seguendo un protocollo sperimentale da noi sviluppato. I risultati riportati in questa tesi mostrano che l’ormone hPL-A stimola la fosforilazione delle proteine AKT e MAPK (p44/p42), da cui si evince un possibile ruolo biologico di PL nel mediare il segnale che induce la sopravvivenza della cellula beta pancreatica; l’analisi di immunofluorescenza indica che le cellule trattate cambiano la loro morfologia ed esprimono marcatori molecolari delle cellule beta pancreatiche (Insulina, Peptide-c, Glut-2 e PDX-1). Inoltre, con l’analisi proteomica (2D-Gel, DIGE) abbiamo valutato il cambiamento nell’espressione proteica associato al differenziamento morfologico e molecolare evidenziato dall’analisi di immunofluorescenza. I risultati ottenuti suggeriscono che la condizione di siero deprivazione e/o di stimolazione ormonale hanno apportato un cambiamento anche nell’assetto del proteoma delle cellule PANC-1, fornendo un quadro coerente con un processo di differenziamento delle cellule tumorali di origine duttale a cellule con caratteristiche morfologiche e funzionali diverse.

Diabetes Mellitus is one of the most widespread pathologies in Western Society and industrialized countries and it shows a modified insulin secretion from the pancreatic beta cells, with consequent hyperglycaemia. To this very day the treatment for the cure of diabetes is insulin and/or surrogates and ultimately the organ transplants. With regard to this, different protocols have been developed for pancreas transplant as for istance the combined pancreas-kidney transplant that seems to allow a better life expectation. At present the technique of Langherans Islet transplant instead of organ tranplant is in progress. Moreover organ transplant and Langherans Islet transplant is limited owing to the scarce availability of donors. To overcome this restriction of organ supplies in many research laboratories studies are in progress as to obtain pancreatic beta cells from differentiation of embryonic stem cells, from bone marrow stem cells, or from pancreatic duct stem cells and also from the de-differentiation and trans-differentiation of different cellular types. It has been proved that pancreatic beta cells can proliferate after numerous physiological and pathophysiological stimuli. A great number of growth factors have shown to encrease proliferation of beta cells, their mass and their function. Among the growth factors the most important are: the Placental Lactogen Hormone (PL), the Growth Hormone (GH) and the Prolactin (PRL), that belong to a family of polipeptidic homologous hormons that are common to different species from primates to teleostei fish. PL is produced by the placenta exclusively during pregnancy and it represents the most important factor for the increase of the Langherans Islet mass and their function. PL exerts a bigger mitogenous actvity on pancreatic beta cells than GH and PRL, therefore it could play a potential role on the survival and funtion of the Islet during and/or after transplant. Our interest is focused on the possible biological role of the hPL-A hormone in the cell differentiation. The aim of this PhD thesis is that of optimising a method of expression and purification of the Human Placental Lactogen Hormone (isoform A) (hPL-A) not commercially available, physiologically active, that can be used in the study of a possible role exerted by hPL-A in the differentiation of pancreatic duct cells in to beta cells and analyzing the molecular mechanism of signal transduction. The cellular lines PANC-1 (human adenocarcinoma of the pancreas duct) have been used in this study. The serum depleted cells have been stimulated for 96 hours with 500 ng/ml of protein purified in our laboratory, following an experimental protocol developped in our laboratory. The results reported in this thesis show that the hormone hPL-A stimulates the phosphorylation of the proteins AKT and MAPK (p44-p42), from which is evicted a possible biological role in favouring the signal that induces the survival of pancretaic beta cells; the immunofluorescence analysis shows that the treated cells change their morphology and express molecular markers of the pancreatic beta cells (Insulin, Peptide-c; Glut-2, Pdx-1). Moreover through the proteomics analysis (2D-Gel and DIGE) we have evaluated the change in the proteic expression associated to the molecular and morphological differentiation shown by the immunofluorescence analysis. The results obtained suggest that the condition of serum depletion and/or hormonal stimulation have brought about a change also in the asset of the proteome of the PANC-1 cells, thus supplying and outline that is coherent with a process of differentiation from duct tumoral cells to cells with different morphological and functional characteristics.