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Title: Rimozione di ocratossina A in un vino modello mediante proteasi acide
Other Titles: Removal of ochratoxin A in a model wine by acid proteases
Authors: Fabianelli, Tiziana
Keywords: Ocratossina A;Proteasi acide;Ochratoxin A;Acid proteases;AGR/15
Issue Date: 3-Oct-2008
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 19. ciclo
Abstract: 
Questa tesi di dottorato ha riguardato lo studio di proteasi acide food-grade una di origine microbica (proteasi aspartica, EC 3.4.23.18) ed una di origine vegetale (proteasi cisteinica, 3.4.4.24) utilizzate per la degradazione di ocratossina A (OTA), aggiunta ad un vino modello (tampone tartarico a pH 3.2 ed etanolo al 12%vol).
Il lavoro di ricerca è stato suddiviso in due parti: una di caratterizzazione ed una di impiego delle proteasi acide selezionate per la detossificazione del vino sintetico dall’OTA.
In una prima fase sono state selezionate dal commercio due proteasi acide sulla base del loro optimum di pH e della capacità di idrolizzare il legame peptidico R-phe. L’attività proteolitica dei due enzimi è stata studiata, in funzione di diversi pH (3.2-3.5-3.8), temperature (25-35-40 °C), concentrazioni di etanolo (fino al 12 %vol.), in presenza di metabisolfito (fino a 100 mg/l) e di tannini procianidinici dei vinaccioli e delle bucce d’uva (da 0.5 a 2 g/l). E’ stato, inoltre, valutato l’effetto sul colore di un vino rosso delle aggiunte di concentrazioni crescenti dei due enzimi.
La proteasi aspartica è risultata più stabile di quella cisteinica alle condizioni chimico-fisiche testate. In particolare il pH, la temperatura, l’etanolo e il metabisolfito di potassio non hanno influenzato l’attività enzimatica della proteasi microbica nelle prime 2h, contrariamente a quanto osservato per la proteasi vegetale. La presenza di tannini delle bucce e soprattutto dei vinaccioli hanno, invece, ridotto in misura significativa l’attività proteolitica di entrambi i preparati. In 24h, comunque, gli enzimi si inattivavano indipendentemente dalle condizioni del mezzo sintetico.
Il monitoraggio del decremento di OTA, indotto dalle proteasi acide, è stato effettuato con metodiche analitiche diverse quali: TLC, spettrofotometria e HPLC con rivelazione fluorimetrica (HPLC-FL). La variazione del contenuto della micotossina è stata esaminata in funzione della concentrazione di enzima, del tempo e delle condizioni di agitazione.
Nelle prove in TLC il calo di concentrazione di OTA, in funzione del tempo di contatto proteasi aspartica-tossina, è stato seguito osservando l’area e l’intensità della fluorescenza delle macchie alla luce UV. Non è stata, comunque effettuata una quantificazione della micotossina.
Per le prove spettrofotometriche è stata effettuata una scansione da 250 a 450 nm della miscela di reazione costituita da proteasi aspartica e OTA, ed è stato monitorato il decremento di tossina a 330 nm.
Il decremento di OTA, registrato nella prova condotta in assenza di agitazione, è stato pari al 20% dopo 20 ore, mentre in condizioni di agitazione continua (400 rpm), ha raggiunto il 38% dopo 24h.
Nelle prove condotte in HPLC-FL, le due proteasi acide ed il substrato sono stati sciolti in provette da 40-ml mantenute a 35°C, in condizioni di continua agitazione (400 rpm). L’attività idrolitica nel tempo è stata analizzata a differenti concentrazioni di enzima ed OTA.
Entrambi gli enzimi hanno mostrato attività degradativa nei confronti della micotossina. La proteasi aspartica, sebbene più stabile alle condizioni chimico-fisiche testate, è risultata, comunque, meno efficace di quella cisteinica. Il calo massimo di OTA osservato in presenza di proteasi vegetale è stato, infatti, del 70% a fronte del 30% ottenuto con la proteasi microbica.

This PhD thesis was aimed at studying ochratoxin A (OTA) removal in a model wine (tartaric buffer at pH 3.2 and ethanol 12%vol) by using two commercial acid proteases of GRAS microbial (aspartic protease, EC 3.4.23.18) or vegetable (cysteinic protease, EC 3.4.4.24) origin. This work reports the main results of the following two activities directed to:
Screening and characterization of the activity of acid microbial and vegetable proteases in a model wine solution;
OTA degradation by means of the two enzymes in model wine solution.
For the characterization trials, the enzymatic activity of two acid proteases was tested in function of different pH (3.2, 3.5, 3.8), and temperatures (25, 35, 40 °C), ethanol concentrations (until 12%vol.), in presence or no of potassium-metabisulfite (until 100 mg/l) and grape tannins of seeds and of skin (0, 5-2 g/l), to reproduce the physical-chemical conditions of wine.
The effect of two proteases on red wine colour was tested too, adding different concentrations (from 20 to 2000 mg/l) of two enzymes.
Aspartic protease was more stable than cysteinic one. In fact, temperature, pH, ethanol and K2S2O5, did not influence protease aspartic activity in short time such as the cysteinic protease. Both proteolytic activity were negatively influenced by tannins. The two enzymes showed a total inactivation in 24h.
For degradation trials, OTA decrement was assessed with three different analytic methods (TLC, spectrophotometric analysis and HPLC-FL), as a function of enzyme concentration, time and stirring conditions.
In TLC trials the OTA degradation, as function of reaction time with aspartic protease, was observed by the decreasing of spot fluorescence brought UV light.
With spectrophotometric analysis the OTA decrease, in presence of aspartic protease, was monitored at 330 nm, as well as the corresponding spectra in the range from 250 to 450 nm.
It was revealed a decrease in OTA of about 20% in 20 hours, without stirring conditions and of about 38% after 24 hours under stirring conditions.
In the trials lead to study OTA degradation in presence of both enzymes, with HPLC-FL, all dispersions were poured in 40-ml flasks kept at 35°C under stirring condition (400 rpm). The time course of hydrolytic activity was assessed at different enzyme and OTA concentrations.
Both the acid proteases tested were able to remove the OTA added to a model wine. Cysteinic acid protease resulted more active than the aspartic one, their corresponding OTA reduction yields being about 70 and 30%, respectively.
Description: 
Dottorato di ricerca in Biotecnologie degli alimenti
URI: http://hdl.handle.net/2067/561
Rights: If not otherwise stated, this document is distributed by the Tuscia University Open Archive under a Creative Commons 2.0 Attribution - Noncommercial - Noderivs License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.0/)
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