Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/547
Title: Caratterizzazione strutturale e funzionale di geni codificanti per proteine della famiglia PDI in frumento tenero
Other Titles: Structural and functional characterisation of genes encoding proteins of the PDI family in bread wheat
Authors: D' Aloisio, Elisa Laura
Keywords: Proteina disolfuro isomerasi (PDI);Famiglia genica;Triticum aestivum;Espressione genica;Struttura genica;Localizzazione cromosomica;Promotore;Sovra-espressione;Protein disulfide isomerase (PDI);Gene family;Gene expression;Gene structure;Chromosome location;Promoter;Over-expression;AGR/07
Issue Date: 10-Sep-2008
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 19. ciclo
Abstract: 
La famiglia PDI (Protein Disulphide Isomerase, Disolfuro Isomerasi) comprende numerosi geni i cui prodotti proteici svolgono funzioni metaboliche diversificate e, dal punto di vista strutturale, differiscono non solo nel numero e posizione dei siti attivi tioredossina simili, ma anche per la presenza/assenza del segnale KDEL, che determina la ritenzione della proteina nel reticolo endoplasmatico, e di altri domini. La meglio caratterizzata tra le proteine codificate da questa famiglia multigenica è la PDI classica, che svolge numerose funzioni metaboliche, la più importante delle
quali, tanto da conferire il nome a questa proteina e all’intera famiglia, viene svolta dai domini tioredossinici attivi e consiste nella formazione e nell’isomerizzazione dei legami disolfuro durante il folding delle proteine di secrezione.
Nelle piante la famiglia PDI è stata suddivisa in otto classi filogenetiche, i prodotti genici di cinque classi presentano
due domini tioredossinici attivi, mentre quelli delle altre tre classi posseggono un solo dominio tioredossinico. Ad eccezione della PDI classica, le informazioni disponibili sugli altri membri di questa famiglia genica riguardano quasi esclusivamente l’isolamento e la determinazione delle sequenze cDNA, mentre sono estremamente limitate le informazioni riguardanti la regolazione della loro espressione e le funzioni metaboliche dei loro prodotti proteici.
Alcuni studi di caratterizzazione molecolare, analisi dell’espressione e localizzazione cellulare in riso e mais hanno suggerito il coinvolgimento della PDI classica nell’assemblaggio e nella deposizione delle proteine di riserva in queste specie. Il probabile intervento della PDI classica e di proteine PDI-like nel folding delle proteine di riserva e nella formazione degli aggregati proteici ad elevato peso molecolare rende particolarmente interessante la loro caratterizzazione in frumento. La qualità tecnologica delle farine di frumento e del glutine è fortemente influenzata, infatti, dalle caratteristiche strutturali delle proteine di riserva, che sono determinate prevalentemente dalla formazione di legami disolfuro intra ed intermolecolari. In frumento erano già state clonate e caratterizzate le sequenze cDNA e genomiche dei tre geni omeologhi codificanti per la PDI classica e le loro sequenze promotrici. L’analisi di espressione aveva rilevato la presenza dei trascritti dei tre geni in tutti i tessuti analizzati, ma le cariossidi in via di sviluppo presentavano un’espressione molto più intensa. L’identificazione di motivi regolatori coinvolti nell’espressione genica
endosperma specifica nei promotori dei tre geni giustifica e spiega l’abbondanza di trascritti nelle cariossidi in maturazione.
Lo scopo della presente tesi di dottorato consiste nell’identificazione e caratterizzazione in frumento tenero di
geni codificanti per proteine PDI-like e nell’ottenimento di costrutti e di linee di frumento transgeniche per l’analisi
funzionale dalla sovra-espressione di un gene codificante per la forma classica della PDI e del suo promotore.
Una ricerca incrociata, utilizzando sequenze PDI-like di riso, nelle banche dati di sequenze EST di frumento “TIGR wheat gene index” e “HarvEST Wheat” ha permesso di individuare e clonare nove sequenze cDNA complete di geni codificanti per proteine PDI-like in frumento. L’analisi filogenetica si è basata sul confronto delle sequenze aminoacidiche dedotte di 52 proteine della famiglia PDI comprendenti, oltre le 10 sequenze PDI e PDI-like di frumento,
quelle di alcune specie vegetali. L’albero filogenetico, costruito con il metodo neighbor-joining (NJ) e valutato mediante analisi bootstrap (PHYLIP versione 3.6), ha permesso di assegnare le sequenze clonate da frumento alle otto classi filogenetiche della famiglia PDI identificate nelle piante; ne consegue che in frumento è stato clonato almeno un gene per ciascuna delle otto classi. L’analisi filogenetica ha evidenziato che sette delle classi della famiglia PDI
possono essere raggruppate in due cladi maggiori, dalle quali è escluso l’ottavo gruppo filogenetico, i cui membri sono i
più divergenti nell’ambito della famiglia PDI delle piante. Una clade comprende i gruppi filogenetici I (PDI classica), II, III e VII, per i quali è possibile ipotizzare che derivino da eventi di duplicazione di un gene ancestrale codificante per una proteina con due domini tioredossina simili attivi, uno all’estremità N-terminale ed uno a quella C-terminale, avvenuti nella specie progenitrice delle monocotiledoni e delle dicotiledoni. L’altra clade comprende gli altri tre gruppi filogenetici (IV, V e VIII), i cui geni codificano per proteine con strutture molto più eterogenee, che non permettono di dedurne chiaramente origine ed evoluzione. L’analisi delle caratteristiche strutturali delle sequenze aminoacidiche dedotte delle nove sequenze clonate, effettuata ricercando motivi conservati in diverse banche dati proteiche, ha
evidenziato una notevole similitudine della loro struttura primaria con quella dei membri dei rispettivi gruppi filogenetici. Il confronto dell’organizzazione genomica di tre geni PDI-like di frumento (TaPDIL2-1, TaPDIL4-1 e TaPDIL5-1) con quella dei loro ortologhi di riso e Arabidopsis ha rilevato un elevato livello di conservazione delle loro caratteristiche strutturali (struttura esoni/introni, lunghezza degli esoni e posizione dei siti attivi) fra i membri di uno stesso gruppo filogenetico; tale conservazione è determinata, verosimilmente, dall’importanza funzionale dei loro
prodotti proteici. La localizzazione cromosomica dei geni codificanti per due proteine PDI-like di frumento (TaPDIL4-1
e TaPDIL5-1) è stata determinata mediante analisi Southern di DNA estratto da linee aneuploidi nulli-tetrasomiche e ditelosomiche di Chinese Spring. Le sequenze geniche codificanti per TaPDIL4-1 sono localizzate nel braccio corto dei cromosomi del gruppo di omeologia 1, quelle della TaPDIL5-1 nel braccio lungo dei cromosomi del gruppo 5. L’analisi northern dei profili di espressione di TaPDIL2-1, TaPDIL4-1, TaPDIL5-1 e TaPDIL1-1 (PDI classica di frumento) ha
rilevato livelli di espressione diversificati nei tessuti analizzati.
Allo scopo di effettuare l’analisi funzionale della PDI classica sono state prodotte linee di frumento tenero transgeniche nelle quali il gene TaPDIL1-1 viene sovra-espresso sotto il controllo di un promotore forte endosperma specifico. L’analisi PCR di una parte delle piante ottenute mediante rigenerazione da embrioni bombardati ha dimostrato che alcune di esse erano transgeniche per il costrutto di sovra-espressione. Infine, per caratterizzare meglio il ruolo del promotore nella regolazione spaziale e temporale dell’espressione di uno dei geni codificanti la PDI, il gene reporter UidA (GUS), è stato posto sotto il controllo di quattro frammenti ottenuti per delezioni progressive dell’estremità 5’. Dai diversi esperimenti di trasformazione biolistica sono state prodotte numerose piante di frumento potenzialmente transgeniche, che dovranno essere analizzate per verificare la presenza dei costrutti.
Durante questa ricerca è stata effettuata una caratterizzazione accurata dell’organizzazione strutturale e del profilo di espressione in diversi tessuti di tre dei nove geni PDI-like clonati in frumento, si prevede, nell’immediato futuro, di estendere questi studi agli altri sei geni. La disponibilità del quadro complessivo delle caratteristiche strutturali e della regolazione dei geni della famiglia PDI in frumento sarà utile per delineare una strategia adeguata per la loro caratterizzazione funzionale, ad esempio attraverso il silenziamento di singoli geni o di gruppi di essi mediante la tecnica dell’interferenza dell’RNA (RNAi). La disattivazione progressiva dei geni PDI e PDI-like permetterà di rilevare l’effetto sulle caratteristiche delle proteine di riserva, chiarendo il loro ruolo nella formazione degli aggregati proteici ed
evidenziando eventuali ridondanze funzionali.

The PDI (Protein Disulfide Isomerase) family includes several genes whose products are responsible for diversified metabolic functions, the proteins differ also for number and position of the active thioredoxin like sites, for presence/absence of other domains and of the KDEL signal of retention in the endoplasmic reticulum. The best characterised among the proteins encoded by this multigenic family is the classical PDI, which accomplishes several metabolic functions, the most important, which confers the name to the whole family, is due to the activity of the
thioredoxin like active domains and consists in disulfide bond formation and isomerization during the folding of secretory proteins. In plants the PDI family includes eight different phylogenetic classes, the gene products of five classes have two thioredoxin like active domains, whereas those of the other three classes own a single thioredoxin like domain. With the exception of the classical PDI, most available information on the other genes of this family concerns cloning and sequencing of cDNAs, but almost nothing is known on the regulation of their expression and the functions of their protein products. Some studies of molecular characterization, expression analysis and cell localisation in rice and maize have suggested the involvement of classical PDI in the assemblage and deposition of storage proteins in
these species. In wheat the likely involvement of classical PDI, as well as the potential participation of PDI-like proteins, in the storage protein folding and in the formation of high molecular weight protein aggregates makes their
study particularly interesting. In fact wheat flour quality is strongly affected by composition and structure of the storage proteins, which are largely determined by the formation of intra- and inter-molecular disulphide bonds. Isolation and
characterization in wheat of the three homoeologous gene sequences encoding classical PDI (TaPDIL1-1) and of their promoter sequences have been reported previously. Expression analyses showed that the transcripts of the genes coding
for this protein, although constitutively present in all the tested tissues, where particularly abundant in developing caryopses. These results are consistent with the identification of several conserved regulatory elements involved in
endosperm specific expression in the promoter sequences of the three homoeologous genes.
The aim of the present work was to identify and characterise new genes coding for PDI-like proteins in hexaploid wheat as well as to obtain molecular constructs and transgenic wheat lines for the functional analysis of an over-expressed gene coding for classical PDI and for the characterization of its promoter.
A cross search using PDI-like sequences of rice in the wheat EST databases “TIGR wheat gene index” and “HarvEST Wheat” identified nine sequences coding for PDI like proteins in wheat, whose full length cDNAs have been cloned. Phylogenetic analysis was based on the comparison of the deduced amino acid sequences of 52 proteins of the
PDI family including, in addition to the ten PDI and PDI-like sequences of wheat, sequences cloned from some plant species. The phylogenetic three, constructed using the neighbor-joining (NJ) method and evaluated through bootstrap analyses (PHYLIP version 3.6), allowed the assignment of the ten sequences of wheat to the eight phylogenetic groups identified in plants. Thus at least one gene has been cloned for each phylogenetic group. Seven subfamilies could be split into two major clades, whereas the eighth group was considered as outgroup, due to its high diversification from
the other subfamilies. The first major clade included the I (classical PDI), II and III phylogenetic groups, whose genes encode proteins containing two thioredoxin active domains, one at the N-terminal end and one at the C-terminal end, as well as the VII group, whose members conserve only the N-terminal active domain. On the basis of this shared feature it is possible to put forward the hypothesis of their common evolutionary origin from duplications of a single ancestral gene which took place in the common progenitor of monocots and eudicots. The second clade comprised the remaining three phylogenetic groups (IV, V e VIII), whose sequences show a much higher heterogeneity, which did not allow to infer any hypothesis on their origin and evolution. The search for conserved motives in the deduced amino acid sequences of the nine isolated genes, by comparison with sequences in different protein data bases, revealed a high level of structural similarity between the proteins encoded by the genes belonging to the same phylogenetic group. The comparison of the genomic organisations of three wheat PDI-like genes (TaPDIL2-1, TaPDIL4-1 e TaPDIL5-1) with their orthologous of rice and Arabidopsis showed a high level of conservation of their structural features (exon/intron
structure, exon length and position of the active sites) among the members of the same phylogenetic group. Most likely such conservation reflects the essential functional role of their encoded proteins. The chromosome location of the genes
encoding two wheat PDI-like proteins (TaPDIL4-1 and TaPDIL5-1) was determined through Southern analyses of DNA extracted from nulli-tetrasomic and ditelosomic lines of Chinese Spring. The three homoeologous gene sequences encoding TaPDIL4-1 were located in the short arm of the group 1 chromosomes, those encoding TaPDIL5-1 in the long
arm of the group 5 chromosomes. Northern analysis of TaPDIL2-1, TaPDIL4-1, TaPDIL5-1 and TaPDL1-1 (wheat classical PDI) detected different expression patterns in the analysed tissues.
Transgenic hexaploid wheat lines over-expressing the classical PDI, whose gene was put under the control of a strong endosperm specific promoter, were produced for the functional characterization of this gene. PCR analyses of a large part of the plants regenerated from bombarded embryos showed that some of them were transgenic for the overexpression construct. For a detailed characterization of the promoter role in the spatial and temporal regulation of the
expression of one of the genes encoding the PDI, the UidA reporter gene (GUS) was put under the control of four fragments obtained by progressive deletions of the 5’ end. The biolistic transformation experiments produced many
potentially transgenic plants, which will be analysed to verify the presence of the constructs carrying the PDI promoter fragments.
Further studies will be necessary to complete the molecular characterisation of this multigenic family in wheat.
The structural characterisation and a detailed analysis of expression patterns will be extended to the remaining six genes encoding PDI-like proteins. An exhaustive knowledge of the structural features and regulation of the PDI family genes will be useful to design the most suitable strategies for their functional characterization, in particular for the silencing of single genes or of gene groups through the RNA interference (RNAi) technology. The effect on the characteristics of seed storage proteins produced by the progressive knock-out of PDI and PDI-like genes will allow the understanding of their role in the formation of protein aggregates and will highlight possible functional redundancies.
Description: 
Dottorato di ricerca in Genetica agraria
URI: http://hdl.handle.net/2067/547
Rights: If not otherwise stated, this document is distributed by the Tuscia University Open Archive under a Creative Commons 2.0 Attribution - Noncommercial - Noderivs License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.0/)
Appears in Collections:Archivio delle tesi di dottorato di ricerca

Files in This Item:
File Description SizeFormat
eldaloisio_tesid.pdf2.6 MBAdobe PDFView/Open
Show full item record

Page view(s)

1
Last Week
1
Last month
0
checked on Oct 30, 2020

Download(s)

13
checked on Oct 30, 2020

Google ScholarTM

Check


This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons