Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/539
Title: Isolamento e caratterizzazione di sequenze cDNA indotte da ozono in frumento duro
Other Titles: Isolation and characterization of cDNA sequences induced by ozone in durum wheat
Authors: Acampora, Andrea
Keywords: Ozono;Inquinamento atmosferico;Stress ossidativo;cDNA-AFLP;Espressione differenziale dei geni;Triticum durum;Ozone;Air pollution;Oxidative stress;Genes differential expression;AGR/07
Issue Date: 27-Aug-2008
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 19. ciclo
Abstract: 
L’inquinamento fotochimico da ozono raggiunge livelli elevati nell’areale di coltivazione del frumento duro in Italia, particolarmente durante la formazione della spiga e la maturazione delle cariossidi. A lungo la scarsità di sintomi evidenti determinati dall’ozono sulle foglie ha fatto ritenere il frumento una specie poco sensibile, mentre studi più accurati in frumento tenero hanno dimostrato effetti deleteri rilevanti sulla produttività, determinati dalla senescenza precoce delle foglie nel periodo molto delicato di maturazione delle cariossidi e accumulo delle sostanze di riserva. L’entità dei danni può variare ampiamente in relazione alla concentrazione dell’inquinante e a fattori atmosferici, ma, a parità di condizioni, esiste anche un’elevata variabilità varietale per la suscettibilità all’ozono. Mentre in specie modello, in particolare in Arabidopsis, esiste una vasta letteratura scientifica sugli aspetti molecolari della risposta all’ozono, le conoscenze relative alle monocotiledoni ed al frumento sono molto limitate. L’importanza economica del frumento duro in Italia e i possibili effetti deleteri dell’inquinamento fotochimico giustificano ampiamente l’esecuzione di programmi di ricerca per comprendere i meccanismi biochimici e molecolari coinvolti nella risposta di questa specie all’ozono.
Lo scopo precipuo del lavoro di ricerca svolto durante l’esecuzione di questa tesi di dottorato consiste nella comprensione dei meccanismi molecolari coinvolti nella risposta allo stress da ozono, identificando, in particolare, i geni la cui espressione viene indotta dall’esposizione a questo inquinante. Lo studio si è articolato nelle seguenti fasi: 1) trattamento con O3 in ambiente controllato di 16 varietà di frumento duro per determinare una scala di tolleranza/suscettibilità; 2) identificazione mediante cDNA-AFLP di trascritti espressi differenzialmente in seguito a stress da ozono, utilizzando prevalentemente uno dei genotipi mediamente tolleranti; 3) caratterizzazione delle sequenze clonate ed analisi dell’espressione dei relativi geni in varietà tolleranti e suscettibili.
Piantine di circa 15 giorni sono state sottoposte ad un trattamento acuto con ozono e al termine del trattamento e nelle successive 5, 24, e 48 ore è stata valutata la comparsa dei sintomi visibili e, sulle piantine trattate e di controllo, sono stati rilevati alcuni parametri fisiologici per valutare la capacità di ritenzione di elettroliti a livello di membrana, il bilancio idrico e l’integrità funzionale dell’apparato fotosintetico. Sulla base delle analisi fisiologiche e sintomatologiche la varietà mediamente tollerante Portorico e, solo nella prima fase di attività, la varietà suscettibile Duilio, sono state utilizzate per l’analisi differenziale. Per alcune delle sequenze isolate mediante cDNA-AFLP sono state condotte analisi di espressione in sei varietà di frumento duro selezionate per la risposta contrastante allo stress da ozono: oltre che in Duilio e Portorico, anche nelle varietà suscettibili, Mongibello e Appio, e nelle varietà tolleranti, Claudio ed Iride.
L’analisi differenziale dei trascritti estratti da piante trattate con ozono e di controllo è stata effettuata con una tecnica cDNA-AFLP modificata rispetto a quella classica. L’analisi di circa 2500 prodotti di amplificazione dei trascritti da piante trattate e di controllo ha permesso di identificare 165 prodotti differenziali indotti da ozono. Le sequenze nucleotidiche ed aminoacidiche dedotte di 122 dei 165 cloni indotti da ozono, la cui espressione differenziale o preferenziale in piante ozonate è stata verificata mediante analisi RT-PCR, sono state confrontate con quelle depositate in diverse banche dati nucleotidiche e proteiche. Per 34 delle 122 sequenze analizzate non è stata rilevata alcuna omologia significativa nei database utilizzati. Per 79 cloni, invece, sono state rilevate significative omologie con sequenze genomiche, cDNA o proteiche isolate nelle piante. E’ interessante notare che tra i 79 cloni che hanno rilevato omologie significative in tutti i database analizzati, solo 13 corrispondono a sequenze di frumento precedentemente riportate in banche dati proteiche e nucleotidiche, mentre per 44 di essi sono state individuate sequenze EST di frumento identiche o molto simili. Infine le rimanenti 9 sequenze sono risultate omologhe solo a ESTs di frumento, indicando probabilmente che esse sono altamente specifiche per questa specie vegetale.
I 79 cloni che presentano omologie significative con sequenze precedentemente caratterizzate di specie vegetali sono stati classificati, in base alle loro funzioni presunte, in sette gruppi: 1) trasduzione del segnale (15 cloni); 2) organizzazione cellulare (9 cloni); 3) sintesi, dislocazione e degradazione delle proteine (9 cloni); 4) metabolismo (11 cloni); 5) protezione/difesa cellulare (12 cloni); 6) regolazione della trascrizione (7 cloni); 7) con funzione sconosciuta (16 cloni). Quarantadue dei 63 trascritti relativi a geni precedentemente caratterizzati corrispondevano a sequenze geniche il cui ruolo nella risposta all’ozono era stato già documentato nelle analisi condotte sul trascrittoma di Arabidopis, confermando l’efficacia del procedimento adottato nell’individuazione di geni coinvolti nella risposta allo stress da ozono in frumento duro. L’assenza di alcune delle sequenze indotte in frumento nel trascrittoma di Arabidopsis potrebbe essere spiegata dalla distanza tassonomica e filogenetica tra le specie o dalle differenti condizioni di esposizione all’ozono.
L’espressione delle 63 sequenze indotte da ozono e omologhe con geni caratterizzati è stata analizzata mediante RT-PCR in sei varietà di frumento duro selezionate per la risposta contrastante allo stress da ozono. Sulla base delle analisi RT-PCR le sequenze sono state classificate in quattro gruppi: il primo gruppo comprendeva 25 sequenze con profilo di espressione identico nelle cultivar tolleranti e in quelle suscettibili (indotte o sovraespresse in condizioni di stress da O3); le 12 sequenze del secondo gruppo erano indotte o sovraespresse solo nelle varietà tolleranti; il terzo gruppo è costituito da 6 sequenze indotte o sovraespresse solo nelle cvs suscettibili; al quarto gruppo, infine, sono state assegnate le rimanenti 20 sequenze con un profilo di espressione complesso nei sei genotipi analizzati. E’ interessante notare che i profili di espressione rilevati per alcune sequenze sono direttamente correlati alla diversa risposta all’ozono mostrata sia a livello sintomatologico che fisiologico dalle sei varietà. Queste sequenze potrebbero quindi rappresentare un punto di partenza importante per lo studio delle basi molecolari della tolleranza/suscettibilità all’inquinante in frumento duro.

In the cultivation area of durum wheat in Italy, there are high levels of photochemical pollution by ozone, in particular during heading time and seed development. The apparent resistance of wheat to ozone is due to light foliar symptoms, but the effects on grain productivity are relevant, due to early foliar senescence during the most sensitive period of grain filling. The damage extent is obviously related to pollutant concentrations and atmospheric characteristics, but there is also a significant intraspecific variation for ozone tolerance. Molecular aspects of the response to ozone stress are well known in Arabidopsis, whereas very little is known in monocots and wheat. Durum wheat production is economically relevant in Italy and the possible damages produced by the photochemical pollution justify research programmes on the biochemical and molecular mechanisms involved in the response of this species to ozone exposure.
In particular the research project included the following three phases: 1) evaluation of 16 durum wheat cultivars for tolerance/susceptibility to O3 by exposure in controlled environment; 2) identification of cDNA-AFLPs induced by O3, using one of the tolerant durum wheat cultivars; 3) sequencing of the induced sequences and expression analysis by RT-PCR in tolerant and susceptible genotypes.
Seedlings were exposed to acute ozone treatment under controlled conditions. Evaluation of the appearance of the necrotic lesions was carried out at the end of the O3 exposure and after 5, 24 and 48 h and their incidence was evaluated by the MacKinney Index. On the basis of leaf damage and of some physiological parameters (gas exchange measurements, leaf chlorophyll fluorescence, membrane solute leakage and relative water content), the O3 tolerant cv Portorico and, during the first stage of activity, the O3-sensitive cv Duilio, have been selected for differential analysis by cDNA-AFLP. For some of the isolated sequences expression analyses have been carried out in six varieties of durum wheat, showing contrasting responsiveness to O3. The expression profiles of the transcripts from two-week old ozonated and control plants were compared by a modified cDNA-AFLP technique. The analysis of about 2500 amplified transcripts from ozonated and control plants detected 165 differential products induced by O3. The nucleotide and deduced amino acid sequences of 122 out of 165 O3-induced clones, whose differential or preferential expression in ozonated plants had been verified by RT-PCR analyses, were searched in the online databases of DNA and protein sequences. Significant homology was found for 88 differential products: 9 detected homologies only within the wheat ESTs, indicating, most likely, their high specificity for this species, whereas 79 found homologous sequences in all the searched databases. No significant homology was detected for the remaining 34 clones. On the basis of their homology with sequences in the databases with known functions, the 79 clones were assigned to seven functional groups: I) signal transduction (15 clones); II) cell organization (9); III) protein synthesis/destination/degradation (9); IV) metabolism (11); V) cell rescue/defence (12); VI) transcription (7); VIII) unknown (16). It is noteworthy that only 13 clones corresponded to wheat sequences reported in DNA and protein databases, and 44 were found within the EST sequences of wheat. Forty-five of the 63 isolated AFLP-tags, found to match genes with known functions, had been previously recognized as O3-responsive in Arabidopsis. On the basis of these results it can be inferred that the modified cDNA-AFLP procedure adopted in this research was effective in detecting O3-responsive genes. The lack in the Arabidopsis transcriptome of some sequences cloned from durum wheat might be explained either by differences between taxonomically distant species or by the different conditions of ozone exposure adopted.
The expression analysis of the 63 sequences induced by ozone which showed significant homology with genes with known function were carried out by RT-PCR in the six durum wheat varieties selected for their contrasting response to ozone stress. On the basis of these analyses the 63 sequences have been classified in four groups: the first group includes 25 sequences that showed similar expression patterns in all the six tolerant and susceptible cvs after exposure to O3; the second one comprises 12 sequences preferentially induced or overexpressed only in tolerant cvs; the third is composed of 6 sequences that were preferentially induced or overexpressed only in susceptible cvs; the forth group includes the remaining 20 sequences that showed very complex expression patterns in the six analysed genotypes. It is noteworthy that the expression patterns of some sequences are directly related with the contrasting responsiveness to O3 of the six varieties. These sequences could therefore represent an important starting point for studies of the molecular mechanisms of tolerance/susceptibility to ozone in durum wheat.
Description: 
Dottorato di ricerca in Genetica agraria
URI: http://hdl.handle.net/2067/539
Rights: If not otherwise stated, this document is distributed by the Tuscia University Open Archive under a Creative Commons 2.0 Attribution - Noncommercial - Noderivs License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.0/)
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