Investigation of ERQC and ERAD using the plant as a model organism

Abstract

In organismi eucarioti, circa un terzo del genoma codifica per proteine che sono destinate a percorrere la via di secrezione; queste proteine tradotte dal ribosoma vengono inserite dentro il lume del Reticolo Endoplasmico (RE) in uno stato non ripiegato. Il lume del RE costituisce un compartimento altamente specializzato che assiste il ripiegamento delle proteine che verranno secrete: il Controllo di Qualità di glicoproteine del Reticolo Endoplasmico (ERQC) e il sistema di Degradazione Associato al RE (ERAD) si occupano di controllare gli stadi iniziali della secrezione di glicoproteine e di mantenere una stabile glicoproteostasi. ERQC e ERAD sono centrali in salute e patologie. Per esempio, la ritenzione mediata da ERQC e/o la degradazione per mezzo di ERAD di una glicoproteina mutante può portare a spiacevoli inconvenienti quando la mutazione causa un piccolo difetto di mal ripiegamento che non è sufficiente ad abrogare la funzione della glicoproteina stessa (“mutante responsivo”): in questi casi l’attività di ERQC/ERAD può causare malessere cellulare perché la secrezione della glicoproteina mutante viene bloccata, impedendo all’organismo di beneficiare della sua attività residua. I sistemi ERQC e ERAD di un ospite possono, inoltre, essere sfruttati da alcuni virus affinché supportino il ripiegamento di glicoproteine virali, oppure degradino delle glicoproteine che hanno funzione di difesa dal patogeno. Inoltre, in cancro, la centralità di alcune glicoproteine di secrezione suggerisce che ERQC e ERAD possano costituire dei potenziali target terapeutici. Infine, ERQC e ERAD giocano un ruolo importante nella Risposta a Proteine Mal ripiegate (UPR) indotto da stress abiotici. Diversi studi in vitro e in cellula, condotti in cellule di lievito e di mammiferi hanno esplorato l’inibizione e/o la modulazione di enzimi facenti parte del sistema ERQC/ERAD in qualità di terapie anticancro, antivirali o per recuperare la secrezione di glicoproteine generate da mutanti responsivi e coinvolte in malattie rare. In questa tesi utilizziamo la pianta come un modello semplice, economico e alternativo per lo studio di ERQC e ERAD in vivo. In particolare, mostriamo che il sistema immunitario di Arabidopsis thaliana (At) e che la disponibilità di piante che sono mutanti per le componenti di ERQC/ERAD, offrono un mezzo per saggiare la funzione di ERQC/ERAD e la loro modulazione osservando l’intero organismo. Allo stesso tempo, mentre le strutture degli enzimi chiave di ERQC (ERα-Glucosidase II (GluII) and UDP-Glucose Glycoprotein Glucosyl Transferase (UGGT)) sono già state determinate, non esiste ancora alcuna struttura relativa agli enzimi ER Degradation-Enhancingα-Mannosidase-like proteins (EDEMs) effettori di ERAD. Nella seconda parte di lavoro descritto in questa tesi, noi abbiamo indagato il genoma di Chaetomium thermophilum alla ricerca di ortologhi dell’eterodimero EDEM:PDI. Abbiamo individuato due geni poco caratterizzati che chiamiamo CtHTM1P e CtPDI1P. Abbiamo dimostrato attività di mannosidasi per CtHTM1P in pianta e abbiamo clonato, espresso e purificato l’eterodimero CtHTM1P:CtPDI1P ottenendo la prima ricostruzione con risoluzione di 18 Å tramite Cryo-Microscopia Elettronica (Cryo-EM).