Exploring variability in free asparagine content to reduce the acrylamide-forming potential of wheat grain

Abstract

Acrylamide, an odourless, organic and water-soluble molecule, has been detected as a contaminant in a wide range of foods that have been exposed to high temperatures during processing (e.g., fried, baked, roasted). Since acrylamide is classified as a probable human carcinogen, many efforts have been made to decrease its content in foods. Acrylamide can be generated during Maillard cascade reactions involving free reducing sugars and free asparagine, the latter having been identified as the limiting factor in acrylamide formation in wheat containing foods. This makes the control of free asparagine content of great importance in crop and food sciences. The aim of this PhD project was to study natural variation in free asparagine levels in durum ((Triticum turgidum L. ssp. durum (Desf.)) and bread (Triticum aestivum L.) wheat grains, and to identify genomic regions involved in free asparagine accumulation in wheat seeds. To achieve these goals, three research activities were carried out. Within a first activity, genetic diversity in relation to free asparagine content in durum wheat was explored. For this purpose, 201 durum wheat genotypes, originating from 33 different countries, were selected from an international collection (the Global Durum Panel). To increase genetic variability, a large number of durum wheat landraces were included in the study. The 201 genotypes were sown in experimental fields located in Fiorenzuola d’Arda (Italy) for three years. Wholemeal flour was obtained from harvested grains and free asparagine was measured. The analysis highlighted the presence of significant variability for this trait in the chosen population. A multi-locus genome-wide association study allowed to identify genomic regions associated to free asparagine content on chromosomes 6A, 7A, 2B, 4B, 7B. A second study aimed to characterise 54 bread wheat élite varieties, relevant for the Italian market, in order to identify genotypes with contrasting free asparagine accumulation levels and evaluate their acrylamide-forming during food processing. Wholemeal flour deriving from seeds harvested in six field trials 2 (three Italian locations, two years) were analysed for free asparagine content. Analysing the 18 genotypes that were present in all the field trials, we monitored how the trait was influenced by genotype and cultivation environment. Some cultivars appeared to be highly affected by environment, whereas others showed a relative stability in free asparagine content across years and locations. Among them, four genotypes were selected for their contrasting levels of free asparagine accumulation (2 genotypes showing low and 2 genotypes showing high free asparagine accumulation across years and cultivation environments). Acrylamide content was measured in pizza produced with flours obtained from these genotypes. The third activity concerned the development of a gene editing protocol to modulate free asparagine content in durum wheat seeds. This work was carried out in collaboration with the research group of Prof. Nigel G. Halford in Rothamsted Research, (Harpenden, Hertfordshire, UK). During a period spent at Rothamsted Research, three guide RNAs (gRNAs) for CRISPR/Cas9-based editing were designed to target the first exon of TdASN2 gene, a key gene in asparagine synthesis which is expressed al late stages of seed development. After the assembly of the vectors, particle bombardment technology was applied to deliver DNA into immature embryos. More than 700 immature embryos were bombarded and 10 plants regenerated from callus, two of which were found to be actually transformed. The activity is still ongoing, and the results obtained so far have evidenced the need to optimise selection media for regeneration and transformant selection.

L'acrilamide è una molecola organica, inodore e idrosolubile, che è stata rilevata come contaminante in un'ampia gamma di alimenti che sono esposti a temperature elevate durante la loro preparazione (ad es. sottoposti a cotture quali frittura, cottura al forno, cibi arrostiti). Poiché l'acrilamide è stata classificata come probabile cancerogeno per l'uomo, sono stati fatti molti sforzi per ridurne il contenuto negli alimenti. L'acrilamide può essere generata durante la reazione di Maillard che coinvolge zuccheri riducenti e asparagina libera (non proteica). Quest'ultima è stata identificata come il fattore determinante nella formazione di acrilamide negli alimenti derivati dal frumento, rendendo il controllo del contenuto di asparagina libera di grande importanza in abito agrario e alimentare. In questo progetto di dottorato è stata studiata la variabilità dei livelli di asparagina libera nella granella di frumento duro ((Triticum turgidum L. ssp. durum (Desf.)) e frumento tenero (Triticum aestivum L.), e sono state identificate regione genomiche associate all’accumulo di asparagina libera nei semi di questi due cereali. Sono state svolte tre diverse attività di ricerca funzionali al raggiungimento degli obiettivi del progetto. La prima attività mirava a esplorare la diversità genetica in relazione al contenuto di asparagina libera nel grano duro. A tale scopo sono stati selezionati, da una collezione internazionale (Global Durum Panel), 201 genotipi di grano duro, originari di 33 paesi diversi. Per garantire un’elevata variabilità genetica, nello studio è stato incluso un gran numero di landraces. I 201 genotipi sono stati seminati in campi sperimentali situati a Fiorenzuola d'Arda (Italia) per tre anni. Sono stati poi misurati i livelli di asparagina libera nella farina integrale ottenuta dalle cariossidi. L'analisi ha mostrato la presenza di una variabilità significativa per questo carattere nella popolazione selezionata. È stato quindi eseguito uno studio di associazione (multi-locus GWAS) per identificare le regioni genomiche associate al contenuto di asparagina libera. Sono stati identificati polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) sui cromosomi 6A, 7A, 2B, 4B, 7B associati al contenuto di asparagina libera. Un secondo studio mirava a caratterizzare 54 varietà élite di frumento tenero di rilevanza per il mercato italiano con l’obiettivo di identificare genotipi con livelli di accumulo di asparagina libera differenziati e valutare la formazione di acrilamide durante la lavorazione degli alimenti prodotti a partire dalle loro farine. Le farine integrali derivanti dalla granella raccolta in sei prove in campo (tre località italiane, due anni) sono state analizzate per il contenuto di asparagina libera. Considerando i 18 genotipi presenti in tutte le prove di campo, è stato evidenziato come il carattere fosse influenzato dal genotipo e dall'ambiente di coltivazione. Per alcune cultivar i lvelli sono risultati molto variabili a seconda dell’ambiente, mentre per altre si è osservata una relativa stabilità nel contenuto di asparagina libera nei diversi anni e nelle differenti località. Tra queste ultime, sono stati selezionati quattro genotipi con livelli differenziati di asparagina libera (2 genotipi che mostrano basso accumulo e 2 genotipi che mostrano alto accumulo di asparagina libera in diversi anni e ambienti di coltivazione). Successivamente è stato misurato il contenuto di acrilamide in pizze prodotte a partire da farine ottenute da questi genotipi. La terza attività ha riguardato lo sviluppo di un protocollo di editing genetico per modulare il contenuto di asparagina libera nei semi di grano duro. Questo lavoro è stato svolto in collaborazione con il gruppo di ricerca del Prof. Nigel G. Halford presso Rothamsted Research, (Harpenden, Hertfordshire, UK). Durante un periodo trascorso presso Rothamsted Research, sono stati progettati tre RNA guida (gRNA) per l'editing basato su CRISPR/Cas9 con lo scopo di bersagliare il primo esone del gene TdASN2, un gene chiave nella sintesi dell'asparagina e che si esprime nelle ultime fasi dello sviluppo del seme. Dopo l'assemblaggio dei vettori, è stata applicata la tecnologia del particle bombardment per veicolare il DNA plasmidico all’interno di embrioni immaturi di frumento duro. Sono stati bombardati più di 700 embrioni immaturi e 10 piante sono state rigenerate, due delle quali sono risultate trasformate. L'attività è tuttora in corso e i risultati finora ottenuti hanno evidenziato la necessità di ottimizzare i mezzi di selezione per la rigenerazione e la selezione dei trasformanti.