Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/46875
Title: SSR markers as a powerful tool for genetics investigation: Anisakis simplex (s. l.) complex (Nematoda: Anisakidae) as a case study
Other Titles: Marcatori SSR come potente strumento di investigazione genetica: il complesso Anisakis simplex (s.l.)(Nematoda: Anisakidae) come caso di studio
Authors: Bello, Eleonora
Keywords: Anisakis;Microsatelliti;Genetica di popolazione;Sex-linked;Ibridazione;Microsatellites;Population genetics;Sex-linked;Hybridization
Issue Date: 18-May-2020
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 32. ciclo
Abstract: 
Il genere Anisakis comprende specie di endoparassiti marini a ciclo vitale complesso, che coinvolge crostacei (krill) quali primi ospiti intermedi, pesci e cefalopodi come ospiti intermedi/paratenici ed infine cetacei come ospiti definitivi. Nove specie appartenenti al genere Anisakis sono state finora descritte e caratterizzate su base genetica e descritte a livello sistematico. L'analisi filogenetica di queste specie ha mostrato, finora, la presenza di quattro cladi principali in cui "clusterizzano" le nove specie di Anisakis. Uno di questi cladi include le specie gemelle del complesso Anisakis simplex (s. l.), comprendente i taxa A. simplex (s. s.), A. pegreffii e A. berlandi. Queste tre specie sono state scoperte impiegando marcatori genetico-molecolari sia nucleari (allozimi, EF1 α-1 nDNA) che mitocondriali (mtDNA cox-2) (Mattiucci et al., 2018).
Nel presente lavoro di tesi, sono stati sviluppati e validati nuovi marcatori nucleari su queste tre specie, al fine di utilizzare numerosi marcatori in un approccio multilocus, per il loro riconoscimento a livello di specie e per poter studiare fenomeni di ibridazione/introgressione nelle aree di simpatria. Mediante NGS, è stato effettuato lo screening di un panel di sette loci microsatelliti (SSRs loci) a partire dalla specie A. pegreffii e poi cross-amplificato sulle altre due specie del complesso. Inoltre, in questo studio sono stati testati anche altri cinque SSR loci, precedentemente isolati da Mladineo et al. (2017) su esemplari di A. simplex (s. l.) (A. pegreffii e A. simplex (s. s.)). Questi ultimi cinque loci sono stati pertanto testati in questo lavoro di tesi su numerosi esemplari delle tre specie di Anisakis. In totale sono stati studiati N=1095 di esemplari delle tre specie, campionati sia in allopatria che in simpatria.
L’analisi delle frequenze alleliche ha mostrato che alcuni dei loci microsatelliti studiati presentano alleli alternativi (diagnostici al 100%) tra le tre specie. L'analisi delle distanze genetiche ottenute dalle frequenze alleliche conferma ulteriormente che le tre specie siano geneticamente ben distinte. L’utilizzo dei loci microsatelliti, parzialmente o totalmente diagnostici, rappresenta un nuovo strumento genetico per la corretta identificazione delle tre specie considerate, sia allo stadio larvale che adulto.
Dallo studio è anche emerso che quattro di questi loci sono risultati essere sex-linked. Un aspetto applicativo di quest'ultimo risultato è la possibilità di determinare il sesso negli stadi larvali (larve L3 e L4). Infine, proprio grazie al potere discriminante mostrato da alcuni di questi marcatori, durante lo studio è stato possibile identificare casi di ibridazione interspecifica tra A. pegreffii e A. berlandi. Infatti, tre individui sono risultati ibridi F1 tra le due specie considerate, in una delle loro zone di simpatria, ossia le acque della Nuova Zelanda. Il risultato ottenuto rappresenta il primo caso di ibridazione tra A. pegreffii e A. berlandi.
Quindi, il contributo di questo lavoro è stato in particolare quello di fornire nuovi strumenti per lo studio a livello genetico delle specie gemelle del complesso A. simplex (s. l.). Tali strumenti, essendo stata verificata la loro attendibilità nel discriminare i tre taxa, potranno essere così impiegati in un approccio multilocus comprendente diversi marcatori nucleari, per poter investigare fenomeni di ibridazione e/o introgressione tra le tre specie in altre aree di simpatria.

The genus Anisakis consists of species of marine endoparasites showing complex life-cycle, involving small crustaceans (krill) as first intermediate hosts, fish and squids as intermediate/paratenic hosts, and finally cetaceans as definitive ones. So far, nine species have been genetically detected; their systematics was also clearly defined. The phylogenetic analysis of those nine species, as inferred from different nuclear and mitochondrial gene sequences analysis, has depicted and those nine Anisakis spp. are clustering in four main clades. One of them includes the complex of sibling species known as Anisakis simplex (s. l.) complex, i.e. A. simplex (s. s.), A. pegreffii and A. berlandi species. Those three species were discovered by employing molecular-genetic markers, both nuclear (allozymes, sequence of EF1 α-1 nDNA gene) and mitochondrial ones (mtDNA cox-2) (Mattiucci et al., 2018).
The present Thesis work was aimed to increase the number of nuclear markers to be used in a multilocus genotyping approach, in the demonstration of reproductive isolation and in the disentangling the hybridization/introgression phenomena occurring between the species of the A. simplex (s.l.) complex, in sympatric areas. Thus, throughout a NGS approach, DNA microsatellite markers were developed and validated on a large number of specimens (N=1095) belonging to the three Anisakis species. A panel of seven SSR loci was newly isolated on A. pegreffii and their cross-amplification was tested on the other two species. Further five SSR loci – previously isolated by Mladineo et al., (2017) on the A. simplex (s. l.) (i.e. A. pegreffii and A. simplex (s. s.)) – were also employed on the same specimens of the three taxa.
Some microsatellite loci, showed alternative alleles (diagnostic at 100%) between the three species. Genetic differentiation as based on allele frequencies at those SSRs loci, confirmed once again, that the three species are clearly distinct biological species, with clear evidence of reproductive isolation. One applicative aspect of the results was that those partially and totally diagnostic microsatellites can be used as a further molecular tools for the reliable identification of those three species, both at larval and adult stage. In addition, in the present study four of those SSR loci resulted to be sex-linked. A consequence of the last finding is the possibility to be used for the gender determination of those nematodes, even at larval stages (i.e. L3-L4 larvae). Finally, in the present study, interspecific hybridization between A. pegreffii and A. berlandi was detected as inferred from diagnostic SSRs loci. Indeed, three specimens were resulted to be F1 hybrids between the above mentioned taxa from one of their sympatric areas, i.e. New Zealand waters. This result represents the first case of hybridization recorded between A. pegreffii and A. berlandi. Since we have proved the reliability of those tools to distinguish the three taxa, they could be employed in a multilocus genotyping approach consisting of other nuclear markers, for investigating hybridization and/or introgression phenomena among the three species in other sympatric areas.
Description: 
Dottorato di ricerca in Ecologia e gestione sostenibile delle risorse ambientali
URI: http://hdl.handle.net/2067/46875
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