An “omic” approach to investigate the interface between the host-parasite system: the case of Anisakis and their natural and accidental hosts

Abstract

The species of the A. simplex (s. l.) complex (i.e. A. pegreffii, A. simplex (s. s.) and A. berlandi) are heteroxenous parasites, involving various marine organisms (krill, fish, squids, cetaceans) in their life-cycles; humans are accidental hosts. Among the Anisakis spp. so far genetically detected, A. pegreffii and A. simplex (s. s.) are so far recognized agents of the fish-borne parasitic zoonosis, anisakiasis. Humans become infected by consumption of parasitized raw or lightly cooked fishery products infected with L3 stage larvae (fish and squids are intermediate/paratenic hosts in the life cycle) (for a review, Mattiucci et al., 2018). From an immunological point of view, somatic and excretory/secretory products of Anisakis spp. larvae determine the activation of the antigen-presenting cells (APCs) such as dendritic cells (DCs). DCs’ activation triggers a strong TH2 response characterized by production of high levels of IL-4, IgE, antibodies and a large number of eosinophilic and mast cells. Large attention has been given in the past to the molecular systematics and phylogeny of Anisakis spp., allowing to depict a clear picture of the wide diversity of existing biological species. On the other hand, only few attempts have been made to describe the genomics, transcriptomics (i.e. gene expression profiles) and proteomics of these nematodes. The research work of this thesis was aimed to investigate about the molecules (and their possible roles) involved in the host-parasite interaction just formed by the infective larval stage (L3) of the zoonotic species of Anisakis and their hosts. Those molecules are likely able to mediate the cross-talk between the Anisakis spp. larvae and their naturally (fish) and accidentally (humans) infected hosts. To reach the main goal of the research, an "omic" approach has been applied. In particular, the following objectives have been pursued: - to investigate the gene expression profiles of antigenic proteins (i.e. A. peg-1, A. peg-7, A. peg. 13) of L3 larvae of Anisakis pegreffii in response to different temperature conditions. Indeed, the temperature has generally been accepted as one of the drivers that influences the rate of biological functions and adaptation of marine parasites. Moreover, literature data report that the temperature can regulate the ES production of Anisakis spp. (Bahool et al., 2012). The chosen genes are those coding for the proteins which are mostly recognized by the human IgE immune-response (Mattiucci et al., 2017). The obtained results suggest that high temperatures (i.e. 20°C, 37°C) may have an effect on the regulation of A. peg-1 and A. peg-13. (Palomba M., Paoletti M., Colantoni A., Rughetti A., Nascetti G., Mattiucci S., 2019. Gene expression profiles of antigenic proteins of third-stage larvae of the zoonotic nematode Anisakis pegreffii in response to temperature conditions. Parasité 26, 52). - to explore the gene expression of some immunogenic and adaptive proteins of Anisakis simplex (s. s.) according to different sites of infection in naturally infected fish hosts. In fish, L3 are moving from the stomach, penetrating the gastric wall, then can be mainly located in the liver and on the mesentery; sometimes can migrate and reach the muscles. During migration, the larvae can modify the structure and function of the host tissues, causing haemorrhages and focal immune reactions (Bahool et al., 2012). Different immune reactions depends on the intensity of infection, the infected host species and the site of infection (Bahool et al., 2012, Levsen et al., 2012; Dezfuli et al., submitted). The findings acquired during this study suggest that the relative gene expression levels of the seven target genes in A. simplex (s. s.) larvae are linked to the infection site in the fish host, blue whiting. The genes encoding for some adaptive proteins seem to have protective proprieties for the parasite, facilitating host tissue migration (i.e. nas 13) and its survival (i.e. TI, GL, hb, treh, hyd) in the basically hostile target tissues of the fish host. (Palomba M., Cipriani P., Giulietti L., Levsen A., Nascetti G., Mattiucci S., 2020. Differences in gene expression profiles of seven target proteins in third-stage larvae of Anisakis simplex sensu stricto by sites of infection in blue whiting (Micromesistius poutassou). Genes, accepted). - to investigate the genetic variation at genes coding for functional proteins in the species of A. simplex (s. l.) complex, such as the peptidases, allowing the discovery of a novel nuclear marker able to distinguish the three species of the A. simplex (s. l.) complex. In nematodes parasites, peptidases represent about 2% of genes expressed (Malagon et al., 2013). In anisakid nematodes they likely represent a category of fast-evolving loci. Indeed, allozyme loci at some peptidases (i.e. Pep-C1, Pep-C2) are among the diagnostic loci between sibling species of the genus Anisakis. The new nuclear marker at the metallopeptidase 10 (nas 10 nDNA) resulted diagnostic at 100% for the identification of specimens of the A. simplex (s. l.) complex. Based on the diagnostic positions detected between the three species of Anisakis, the amplification refractory mutation system (ARMS) method was used for a rapid, reliable, simple genotyping of specimens of the target parasite species to be used in a multilocus genotyping approach. (Palomba M., Paoletti M., Webb S.C, Nascetti G., Mattiucci S., 2020. A novel nuclear diagnostic marker and development of ARMS-PCR assay at the metallopeptidase 10 (nas 10 nDNA), for genotyping of the sibling species of the Anisakis simplex (s. l.) complex (Nematoda: Anisakidae) Parasite, in press), doi 10.1051/parasite/2020033 - another objective has been to carry out a comparative transcriptomic (RNA seq) analysis of A. pegreffii larvae exposed/not exposed to dendritic cells (DCs), in order to identify and characterize A. pegreffii molecules involved in the DCs’modulation. It was indeed previously demonstrated that A. pegreffii has an immunomodulatory role on DCs biology and functions; the alive larvae induce apoptosis, differentiation and reduce DCs ability to migrate to lymph nodes (Napoletano et al., 2018). The results on the transcripts analysis of those L3 under different conditions (DCs+/DC-) have evidenced 1209 differentially expressed genes (p< 0.01, FDR< 0.05, log FC > |2|), 575 genes upregulated in A. pegreffii larvae exposed to DCs and 639 genes upregulated in A. pegreffii not exposed to DCs. Results of genes set enrichment analysis identify the specific functional categories significantly up-represented. The preliminary investigations, focused on the molecular function (MF), reveal a significant increase of the expression of genes in A. pegreffii exposed to DCs with -peptidase, structural constituents of cuticle, proteins with antioxidant activity, heme and chitin binding proteins

Le specie del complesso A. simplex (s. l.) comprendono nematodi parassiti eteroxeni, con ciclo di vita indiretto che si svolge tra organismi che si trovano a diversi livelli trofici di un ecosistema marino (krill, pesci, cefalopodi, cetacei); l’uomo rappresenta un ospite accidentale nel ciclo di vita di questi parassiti. L’ingestione accidentale della larva a seguito di consumo di pesce crudo e/o poco cotto può causare nell'uomo una manifestazione zoonotica nota come anisakiasi (Mattiucci et al., 2018). Allo stato attuale, soltanto le due specie. A. simplex (s. s.) e A. pegreffii sono zoonotiche per l’uomo. Da un punto di vista immunologico, antigeni somatici e prodotti escretori/secretori di larve L3 di queste due specie determinano l’attivazione delle cellule APC (cellule che presentano l’antigene), e principalmente le cellule dendritiche (DC). L’attivazione delle DC innesca una risposta di tipo TH2 caratterizzata dalla produzione di alti livelli di IL-4, IgE, anticorpi e un gran numero di eosinofili e mastociti. Tuttavia, se da un lato in questi ultimi anni la ricerca ha aumentato la conoscenza sulla sistematica molecolare, filogenesi ed ecologia delle specie di Anisakis, d’altra parte sono ancora pochi gli studi di genomica, trascrittomica (intesa come espressione genica) e proteomica di questi nematodi. Il lavoro di ricerca di questa tesi ha avuto l’obiettivo di studiare parte delle molecole (e i loro possibili ruoli) coinvolte nelle interazioni ospite-parassita. Sono proprio queste molecole a mediare il cross-talk tra le larve L3 di specie zoonotiche del complesso A. simplex e gli ospiti naturali (pesce) ed accidentali (uomo). Per raggiungere questo obbiettivo è stato applicato un approccio di tipo “omico”. In particolare sono stati perseguiti i seguenti obiettivi, che hanno portato a relativi risultati: - Studiare i profili di espressione genica di proteine antigeniche (A. peg-1, A. peg-7, A. peg. 13) in larve di A. pegreffii in risposta a differenti condizioni di temperatura. Questi antigeni sono anche quelli riconosciuti dalla risposta immunitaria IgE medianta nell'uomo (Mattiucci et al., 2017). La temperatura è uno dei principali drivers in grado di influenzare il grado delle funzioni biologiche e l’adattamento dei parassiti marini. In Anisakis spp. la temperatura sembrerebbe in grado di regolarne la sopravvivenza e la produzione e secrezione delle proteine (Bahlool et al., 2013). I risultati ottenuti mostrano un aumento significativo dell’espressione genica di A. peg-1 e A. peg-13 in funzione della temperatura (20°C, 37°C). (Palomba M., Paoletti M., Colantoni A., Rughetti A., Nascetti G., Mattiucci S., 2019. Gene expression profiles of antigenic proteins of third-stage larvae of the zoonotic nematode Anisakis pegreffii in response to temperature conditions. Parasité 26, 52). - Esplorare l’espressione genica di alcune proteine immunogeniche e adattative in L3 di A. simplex (s. s.) in relazione al sito di localizzazione nel pesce. In quest’ultimo, le L3 si spostano, dal lume dello stomaco, mediante la penetrazione della parete gastrica, localizzandosi (ed incistandosi) principalmente sul fegato e sui mesenteri; possono altresì effettuare una migrazione viscero-somatica raggiungendo la muscolatura. Dati in letteratura riportano una differente reazione immunitaria in funzione, non solo all’intensità di infezione, ma anche della specie ittica infettata (Levsen et al., 2012) e del sito di localizzazione delle larve (Dezfuli et al., submitted). I risultati ottenuti durante questo studio suggeriscono che i livelli di espressione dei sette geni bersaglio in larve di A. simplex (s. s.) sono correlati ai differenti siti di infezione nel pesce. I geni che codificano per alcune proteine sembrano avere proprietà protettive per il parassita, facilitando la migrazione (nas 13) e la sopravvivenza (TI, GL, hb, treh, hyd) del parassita in tessuti immunologicamente ostili. (Palomba M., Cipriani P., Giulietti L., Levsen A., Nascetti G., Mattiucci S., 2020. Differences in gene expression profiles of seven target proteins in third-stage larvae of Anisakis simplex sensu stricto by sites of infection in blue whiting (Micromesistius poutassou). Genes, accepted). - Studiare la variazione genica di geni funzionali come le peptidasi nelle specie del complesso A. simplex (s. l.), al fine di individuare nuovi marcatori nucleari da utilizzare nella genotipizzazione di esemplari delle tre specie del complesso, in un approccio multilocus. Nei parassiti nematodi, le peptidasi rappresentano circa il 2% dei geni espressi (Malagon et al., 2013); nei nematodi anisakidi rappresentano una categoria di fast-evolving loci. Loci allozimici codificanti per alcune peptidasi risultano essere diagnostici tra le specie del suddetto complesso. L'analisi delle sequenze alla posizione 173 e 251 (nas 10 nDNA) ha mostrato posizioni nucleotidiche diagnostiche tra le tre specie del complesso. Il marcatore è risultato diagnostico al 100% per riconoscimento delle specie da utilizzare in un approccio multilocus. Sulla base delle suddette posizioni nucleotidiche diagnostiche, è anche stato messo a punto e validato, su un largo numero di esemplari, il metodo ARMS (amplification refractory mutation system) per una rapida e specifica genotipizzazione dei nematodi appartenenti alle tre specie del complesso oggetto di studio. (Palomba M., Paoletti M., Webb S.C, Nascetti G., Mattiucci S., 2020. A novel nuclear diagnostic marker and development of ARMS-PCR assay at the metallopeptidase 10 (nas 10 nDNA), for genotyping of the sibling species of the Anisakis simplex (s. l.) complex (Nematoda: Anisakidae) Parasite, in press), doi 10.1051/parasite/2020033 - Altro obiettivo di questo lavoro è stato quello di condurre un’analisi trascrittomica comparativa tra larve di A. pegreffii in presenza/assenza di cellule dendritiche, al fine di identificare e caratterizzare geni codificanti proteine/molecole del parassita coinvolte nella modulazione delle DC. Precedenti studi avevano dimostrato che A. pegreffii ha un ruolo immunomodulatore sull' espressione e funzionalità delle DC. I risultati hanno evidenziato la presenza di 1209 geni differenzialmente espressi (p< 0.01, FDR< 0.05, logFC |2|): 575 geni up-regolati in larve di A. pegreffi esposte alle DC e 639 geni up-regolati in larve non esposte alle cellule dendritiche. I risultati ottenuti, a seguito di analisi di arricchimento, identificano le categorie significativamente sovra-rappresentate e rivelano, tra i geni con funzione molecolare, una significativa sovra-rappresentazione di -peptidasi, costituenti strutturali di cuticola, proteine con attività antiossidante e proteine di legame heme e chitina.