Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/46301
Title: Natural products for cancer therapy: bio-molecular perspectives on anti-tumour properties of climacostol and its analogues
Other Titles: Prodotti naturali per la terapia del cancro: prospettive bio-molecolari sulle proprietà antitumorali del climacostolo e dei suoi analoghi
Authors: Proietti Serafini, Francesca
Keywords: Apoptosis;Autophagy;p53;Tumour cells;Natural products and derivatives;Apoptosi;Autofagia;Cellule tumorali;Prodotti naturali e derivati;BIO/09
Issue Date: 13-May-2020
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 31. ciclo
Abstract: 
Several modern drugs, including those for cancer therapy, are natural products or their semisynthetic derivatives. Some of them have gone on to become current drug candidates, others are in clinical trials. The success of natural products in drug discovery is related to their inherently structural diversity, and to the new technologies in use, such as automated separation techniques, highthroughput screening and combinatorial chemistry, to exploit their feature. Natural compounds may act either as chemo-preventive agents or as factors that increase therapeutic efficacy of existing drugs, thus counteracting cancer cell drug resistance. Marine environment, due to its physical and chemical conditions, has proven to be a novel source for structural entities with biological activity. Despite of exploration of the marine environment has led to the isolation of thousands of bioactive marine molecules, the therapeutic application of these molecules remains poorly investigated. Herein we describe the biological activities in mammalian cells of Climacostol, a compound produced by the ciliated protozoan Climacostomum virens, focusing on its anti-tumour action and its possible therapeutic activity. Climacostol displayed cytotoxic properties in vitro, thus causing a reduction of viability/proliferation of different tumour and non-tumour cell lines. Importantly, climacostol toxicity was more selective against tumour than non tumour cells. We then focused on the B16-F10 mouse melanoma cells. Climacostol mode of action has been linked to its ability to interact with the DNA double helix, causing DNA damage, and subsequently inducing the intrinsic apoptotic pathway in B16-F10 mouse melanoma cells. Of interest, we found that the apoptotic mechanism of climacostol based on the up-regulation of p53 and its pro-apoptotic targets, such as Noxa and Puma. In addition, in vivo melanoma progression was studied using a B16-F10 allograft transplantation tumour model. When melanomas were treated with intra-tumoural injections of climacostol, it significantly improved the survival of transplanted mice, decreased tumour growth rate and tumour weight, induced a notable reduction of viable cells inside the tumour, activated apoptosis and up-regulated the p53 signalling network. Autophagy is a self-eating process by which aged or damaged intracellular organelles and proteins are degraded into lysosomes via autophagosomes, which occurs at a basal level in all eukaryotic cells and may support cell survival or activate death pathways. It has been shown that autophagy can have a binary function, acting as a tumor suppressor in the early stages of cancer and tumor enhancer in established tumours. Thus, we investigated how climacostol regulates autophagy as well as the involvement of p53-dependent mechanisms and their impact on cell death/survival. Using both in vitro and in vivo approaches, we
showed that climacostol potently and selectively impairs autophagy in B16-F10 mouse melanoma cells, which were committed to die by apoptosis. In particular, we monitored autophagy over time and we observed that climacostol exerts a marked and sustained buildup of autophagosomes as the result of dysfunctional autophagosomal degradation. Hence, our data indicated that the pro-apoptotic function of climacostol could be attributed to the block of autophagosome turnover. The mechanistic insights we obtained disclosed a two-edged role played by climacostol in either promoting autophagy, independently on p53 levels, or suppressing autophagosome turnover via the up-regulation of p53, thus more autophagic vacuoles may be accumulated in melanoma cells, further contributing to cell death. The p53-dependent regulation of AMPK activity is the major responsible of climacostol-induced autophagy disruption, although the mTOR pathway unrelated to p53 levels also plays a role. Since the up-regulation of the p53 system is at the molecular crossroad regulating both the anti autophagic action of climacostol and its role in the apoptosis induction, it might be important to explore the dual targeting of autophagy and apoptosis with agents acting on p53 for the selective killing of tumours.

Diversi farmaci moderni, compresi quelli per la terapia del cancro, sono prodotti di origine naturale o loro derivati semisintetici. Il successo dei prodotti naturali nella scoperta di nuovi farmaci è legato alla loro diversità strutturale intrinseca e alle nuove tecnologie in uso, come le tecniche di separazione automatizzata, lo screening ad alta velocità e la chimica combinatoria. I composti naturali possono agire sia come agenti chemo-preventivi sia come fattori che aumentano l'efficacia terapeutica di farmaci esistenti, contrastando così la resistenza delle cellule tumorali ai singoli farmaci. L'ambiente marino, grazie alle sue caratteristiche fisiche e chimiche, ha dimostrato di essere una fonte inesauribile per entità strutturali con attività biologica. Nonostante l'esplorazione dell'ambiente marino abbia portato all'isolamento di migliaia di molecole bioattive, l'applicazione terapeutica di queste molecole rimane scarsamente studiata. Qui di seguito descriviamo le attività biologiche nelle cellule di mammifero del climacostolo, un composto di origine naturale prodotto dal protozoo ciliato di acqua dolce Climacostomum virens, concentrandoci sulla sua azione antitumorale e sulla sua possibile attività terapeutica. Il climacostolo mostra proprietà citotossiche in vitro, causando una riduzione della vitalità e della proliferazione di diverse linee cellulari sia tumorali che non tumorali. È importante sottolineare che la tossicità della molecola è più selettiva nei confronti delle cellule tumorali rispetto a quelle non tumorali. In particolare, in questa tesi ci siamo concentrati su una linea cellulare di melanoma di topo, le cellule B16-F10. Il climacostolo, una volta all’interno delle cellule B16-F10 è in grado di interagire con la doppia elica del DNA, causando danni e inducendo successivamente apoptosi tramite la via intrinseca. Degno di nota, abbiamo scoperto che il meccanismo apoptotico innescato dalla molecola si basa sulla up-regolazione di p53 e dei suoi bersagli pro-apoptotici, quali Noxa e Puma. Inoltre, abbiamo analizzato la progressione del melanoma in vivo utilizzando un modello di trapianto allogenico. Grazie ad iniezioni intra-tumorali del climacostolo, la sopravvivenza dei topi trapiantati è aumentata significativamente, contemporaneamente è diminuito il tasso di crescita tumorale, così come il peso delle masse tumorali. Infatti, la molecola ha indotto una notevole riduzione delle cellule vitali all'interno del tumore, per via dell’apoptosi attivata dalla via di segnalazione di p53. Sulla base di ciò, abbiamo rivolto il nostro interesse al processo autofagico, un processo attraverso il quale gli organelli intracellulari invecchiati o danneggiati e le proteine vengono degradati nei lisosomi tramite gli autofagosomi. Tale fenomeno si verifica a livello basale in tutte le cellule eucariotiche e può supportare la sopravvivenza cellulare o attivare i percorsi di morte. In particolare, è stato dimostrato che l'autofagia può avere una funzione binaria, agendo come soppressore del tumore nelle fasi iniziali della progressione tumorale o come promotore tumorale nei tumori esistenti. Quindi, utilizzando lo stesso approccio sperimentale, abbiamo studiato come il climacostolo regola l'autofagia e il coinvolgimento dei meccanismi p53-dipendenti e il loro impatto sulla morte / sopravvivenza cellulare. Il climacostolo altera in modo potente e selettivo l'autofagia nelle cellule B16-F10 di melanoma di topo. In particolare, abbiamo monitorato l'autofagia nel tempo e abbiamo osservato che il climacostolo esercita un marcato e prolungato accumulo di autofagosomi a seguito della mancata degradazione autofagosomale. Alla luce di ciò, i nostri dati suggeriscono che la funzione pro-apoptotica del climacostolo può essere attribuita al blocco del turnover degli autofagosomi. Le intuizioni meccanicistiche ottenute hanno rivelato un ruolo a doppio taglio del climacostolo nell'aumentare l'autofagia, indipendentemente dai livelli di p53, o nel sopprimere il turnover degli autofagosomi tramite la sovra-regolazione di p53, quindi più vacuoli autofagici si accumulano nelle cellule di melanoma, più queste vanno incontro a morte cellulare. Poiché la sovra-regolazione del network di p53 è al crocevia molecolare che regola sia l'azione anti-autofagica del climacostolo che il suo ruolo nell'induzione dell'apoptosi, potrebbe essere importante esplorare il doppio targeting di autofagia ed apoptosi con agenti che agiscono su p53 per determinare la morte selettiva delle cellule tumorali.
Description: 
Dottorato di ricerca in Scienze, tecnologie e biotecnologie per la sostenibilità
URI: http://hdl.handle.net/2067/46301
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