Plastic marine debris and their additives: in vitro assessment of phthalates cytotoxicity and genotoxicity on European sea bass and bottlenose dolphin cell lines

Abstract

Marine pollution from anthropogenic litter has become a serious worldwide environmental concern, resulting in multiple ecological consequences. Around 6.4 million tonnes of litter enter the oceans each year, thus rendering not negligible litter impacts on the marine environment. Marine litter is extensively distributed in the marine environment, and plastic debris accounts for the majority of litter items in the sea (60 – 90 %), becoming a major source of pollutants. Among them, Di(2-ethylhexyl)- phthalate (DEHP) is the most abundantly used plastic additive, resulting to be a potential ubiquitous contaminant to the marine environment. DEHP and one of its primary metabolites, mono(2- ethylhexyl) phthalate (MEHP), have been extensively studied in the last decades, demonstrating their influence in biochemical processes both in humans and wildlife. However, studies on its toxicological effects on marine organisms are still scarce, despite these studies could play a key role to solicit the development of necessary measures to face this environmental emergency. In this PhD project, we studied the cytotoxic, genotoxic, and mutagenic effects of DEHP and MEHP, by applying specific in vitro tests, in two coastal species of ecological and economic value: the European sea bass embryonic cell line (DLEC) and bottlenose dolphin skin cell line (TT); the latter was evaluated in comparison to the standardized Chinese Hamster Ovary cell line (CHO). DEHP results on DLEC showed a significant decrease in cell viability starting at 0.01 mM after 24 h together with a significant increase in apoptosis and necrosis, morphological changes and cell detachment. MEHP displayed a slight effect on DLEC viability but no effect in the induction of apoptosis and necrosis at all tested concentrations. The higher toxicity of DEHP could be attributed to a synergic effect of both DEHP and its metabolites, which are produced by the cellular metabolism of the DEHP. Furthermore, DEHP caused a moderate increase in DNA strand breaks from 0.02 mM, whereas MEHP did not enhance DNA fragmentation at the tested concentrations. Yet, both DEHP and MEHP caused a dose-dependent increase of micronucleus frequency, which is considered a marker of permanent DNA damage, displaying half of the micronuclei induced by MEHP, with respect to DEHP, at the same concentration (10 µM). These outcomes suggested a possible aneugenic effect of these compounds on DLEC cell line, probably mainly ascribed to MEHP. Our results demonstrate that in vitro exposure to DEHP had a dose-dependent cytotoxic and genotoxic effects in DLEC cell line, whereas MEHP resulted more dangerous than its precursor because it induces genomic instability in the DLEC cell line without triggering cell death. Results on the mammalian cell lines show a dose-dependent reduction in the viability of TT after 24 hours of treatment, starting from low/intermediate doses (0.02 and 0.1 mM of DEHP), and a slight but not significant increase in necrotic cells, except for the 5 mM dose. Instead in CHO a significant decrease in cell viability was observed, along with a significant increase in necrotic cells, at all tested doses of DEHP. Although DEHP treatment of both lines did not increase DNA fragmentation at any of the concentrations tested, a dose-dependent increase in the frequency of micronucleus was observed, accompanied by a progressive decrease in cell proliferation. These data further support the hypothesis that DEHP could have an aneugenic effect, probably due to the production of its metabolites, in particular MEHP. Furthermore, comparing the current results with those obtained in the study on the European sea bass embryonic cell line, the degree of DEHP toxicity on the tree cell lines resulted in this decreasing order: DLEC > CHO > TT. In conclusion, the results of the whole work underline the importance of deepening the study of the cytotoxic and genotoxic effects of phthalates on in vitro systems, especially for protected species, and to undertake further investigations on their effects in in vivo and/or ex vivo cellular systems of marine organisms.

L'inquinamento marino causato dai rifiuti antropogenici è diventato un serio problema ambientale a livello mondiale, con molteplici conseguenze ecologiche. Circa 6,4 milioni di tonnellate di rifiuti entrano ogni anno negli oceani, rendendo così non trascurabili i loro effetti sull'ambiente marino. I rifiuti marini sono ampiamente distribuiti nell'ambiente marino ed i detriti plastici rappresentano la maggior parte dei rifiuti in mare (60 - 90%), diventando una fonte importante di inquinanti. Tra questi, il di (2-ethylhexyl) ftalato (DEHP) è l'additivo delle plastiche più utilizzato, risultando essere un contaminante potenzialmente onnipresente in mare. Il DEHP e uno dei suoi principali metaboliti, il mono (2-etilesil) ftalato (MEHP), sono stati ampiamente studiati negli ultimi decenni, dimostrando la loro influenza sui processi biochimici sia nell'uomo che nella fauna selvatica. Tuttavia, gli studi sui loro effetti tossicologici sugli organismi marini sono ancora scarsi, nonostante tali studi possano rivestire un ruolo fondamentale per sollecitare l’avvio dei provvedimenti necessari per fronteggiare questa emergenza ambientale. In questo progetto di dottorato, abbiamo studiato gli effetti citotossici, genotossici e mutageni del DEHP e dell’MEHP, applicando specifici test in vitro, in due linee cellulari di specie costiere di elevato valore ecologico ed economico, utilizzando una linea cellulate embrionale di spigola (DLEC) ed una di cute di tursiope (TT); quest'ultima è stata valutata a confronto con la linea cellulare standardizzata di ovaio di criceto cinese (CHO). I risultati del DEHP sulle DLEC hanno mostrato una significativa diminuzione della vitalità cellulare a partire da 0,01 mM dopo 24 ore di trattamento, insieme ad un significativo aumento di apoptosi e necrosi, a cambiamenti morfologici delle cellule ed a un aumentato distacco cellulare. Il trattamento con MEHP ha mostrato un leggero effetto negativo sulla vitalità delle DLEC ma nessun effetto sull'induzione di apoptosi e necrosi a tutte le concentrazioni testate. La maggiore tossicità del DEHP potrebbe essere attribuita ad un effetto sinergico sia del DEHP che dei suoi metaboliti, che vengono prodotti dal metabolismo cellulare a partire da quest’ultimo. Inoltre, il trattamento con DEHP ha portato ad un moderato aumento delle lesioni al DNA a partire da 0,02 mM, mentre l’MEHP non ha incrementato frammentazione del DNA a nessuna delle concentrazioni testate. Tuttavia, sia il DEHP che l’MEHP hanno causato un aumento dose-dipendente della frequenza dei micronuclei, considerati marcatori di danno permanente al DNA, producendo la metà dei micronuclei indotti dall’MEHP, rispetto al DEHP, alla stessa concentrazione (10 μM). Questi risultati suggeriscono un possibile effetto aneugenico di questi composti sulla linea cellulare DLEC, probabilmente associato principalmente all'azione dell’MEHP. I nostri risultati dimostrano che l'esposizione in vitro al DEHP ha effetti citotossici e genotossici dose-dipendenti nella linea cellulare DLEC, mentre l’MEHP risulta più pericoloso del suo precursore, poiché induce un'instabilità genomica nella linea cellulare DLEC senza innescare la morte cellulare. I risultati sulle linee di mammifero mostrano una riduzione dose-dipendente nella vitalità delle cellule di TT dopo 24 ore di trattamento a partire dalle dosi basse/intermedie (0.02 e 0.1 mM di DEHP) e un leggero e non significativo aumento delle cellule necrotiche, fatta eccezione che per la dose di 5 mM, mentre nelle CHO è stata osservata una significativa diminuzione della vitalità cellulare, insieme ad un significativo aumento delle cellule necrotiche, a tutte le dosi di DEHP. Sebbene il trattamento con DEHP di entrambe le linee non abbia incrementato la frammentazione del DNA a nessuna delle concentrazioni testate, è stato osservato un aumento dose-dipendente della frequenza dei micronuclei, accompagnato da una progressiva diminuzione della proliferazione cellulare. Questi dati supportano ulteriormente l'ipotesi che il DEHP potrebbe avere un effetto aneugenico, probabilmente dovuto alla produzione dei suoi metaboliti, in particolare dell’MEHP. Inoltre, il confronto di questi ultimi risultati con quelli ottenuti nello studio sulle cellule embrionali di spigola europea, suggerisce un ordine di tossicità del DEHP come segue: DLEC > CHO > TT. In conclusione, i risultati dell'intero lavoro sottolineano l'importanza di approfondire lo studio degli effetti citotossici e genotossici degli ftalati sui sistemi in vitro, soprattutto per le specie protette, e di intraprendere ulteriori indagini sui loro effetti nei sistemi cellulari in vivo e/o ex vivo di organismi marini.