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Title: Plastic marine debris and their additives: in vitro assessment of phthalates cytotoxicity and genotoxicity on European sea bass and bottlenose dolphin cell lines
Other Titles: Rifiuti marini plastici ed i loro additivi: valutazione in vitro della citotossicità e genotossicità degli ftalati su linee cellulari di spigola e tursiope
Authors: Molino, Chiara
Keywords: Phthalates;DNA damage;Cytotoxicity;Genotoxicity;European sea bass cell line;Bottlenose dolphin cell line;Ftalati;Danno al DNA;Citotossicità;Genotossicità;Linea cellulare di spigola;Linea cellulare di tursiope;BIO/07
Issue Date: 18-Oct-2019
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 31. ciclo
Abstract: 
Marine pollution from anthropogenic litter has become a serious worldwide environmental concern,
resulting in multiple ecological consequences. Around 6.4 million tonnes of litter enter the oceans
each year, thus rendering not negligible litter impacts on the marine environment. Marine litter is
extensively distributed in the marine environment, and plastic debris accounts for the majority of litter
items in the sea (60 – 90 %), becoming a major source of pollutants. Among them, Di(2-ethylhexyl)-
phthalate (DEHP) is the most abundantly used plastic additive, resulting to be a potential ubiquitous
contaminant to the marine environment. DEHP and one of its primary metabolites, mono(2-
ethylhexyl) phthalate (MEHP), have been extensively studied in the last decades, demonstrating their
influence in biochemical processes both in humans and wildlife. However, studies on its toxicological
effects on marine organisms are still scarce, despite these studies could play a key role to solicit the
development of necessary measures to face this environmental emergency. In this PhD project, we
studied the cytotoxic, genotoxic, and mutagenic effects of DEHP and MEHP, by applying specific in
vitro tests, in two coastal species of ecological and economic value: the European sea bass embryonic
cell line (DLEC) and bottlenose dolphin skin cell line (TT); the latter was evaluated in comparison to
the standardized Chinese Hamster Ovary cell line (CHO).
DEHP results on DLEC showed a significant decrease in cell viability starting at 0.01 mM after 24 h
together with a significant increase in apoptosis and necrosis, morphological changes and cell
detachment. MEHP displayed a slight effect on DLEC viability but no effect in the induction of
apoptosis and necrosis at all tested concentrations. The higher toxicity of DEHP could be attributed
to a synergic effect of both DEHP and its metabolites, which are produced by the cellular metabolism
of the DEHP. Furthermore, DEHP caused a moderate increase in DNA strand breaks from 0.02 mM,
whereas MEHP did not enhance DNA fragmentation at the tested concentrations. Yet, both DEHP
and MEHP caused a dose-dependent increase of micronucleus frequency, which is considered a
marker of permanent DNA damage, displaying half of the micronuclei induced by MEHP, with
respect to DEHP, at the same concentration (10 µM). These outcomes suggested a possible aneugenic
effect of these compounds on DLEC cell line, probably mainly ascribed to MEHP. Our results
demonstrate that in vitro exposure to DEHP had a dose-dependent cytotoxic and genotoxic effects in
DLEC cell line, whereas MEHP resulted more dangerous than its precursor because it induces
genomic instability in the DLEC cell line without triggering cell death.
Results on the mammalian cell lines show a dose-dependent reduction in the viability of TT after 24
hours of treatment, starting from low/intermediate doses (0.02 and 0.1 mM of DEHP), and a slight
but not significant increase in necrotic cells, except for the 5 mM dose. Instead in CHO a significant
decrease in cell viability was observed, along with a significant increase in necrotic cells, at all tested
doses of DEHP. Although DEHP treatment of both lines did not increase DNA fragmentation at any
of the concentrations tested, a dose-dependent increase in the frequency of micronucleus was
observed, accompanied by a progressive decrease in cell proliferation. These data further support the
hypothesis that DEHP could have an aneugenic effect, probably due to the production of its
metabolites, in particular MEHP.
Furthermore, comparing the current results with those obtained in the study on the European sea
bass embryonic cell line, the degree of DEHP toxicity on the tree cell lines resulted in this decreasing
order: DLEC > CHO > TT.
In conclusion, the results of the whole work underline the importance of deepening the study of the
cytotoxic and genotoxic effects of phthalates on in vitro systems, especially for protected species, and
to undertake further investigations on their effects in in vivo and/or ex vivo cellular systems of marine
organisms.

L'inquinamento marino causato dai rifiuti antropogenici è diventato un serio problema ambientale a
livello mondiale, con molteplici conseguenze ecologiche. Circa 6,4 milioni di tonnellate di rifiuti
entrano ogni anno negli oceani, rendendo così non trascurabili i loro effetti sull'ambiente marino. I
rifiuti marini sono ampiamente distribuiti nell'ambiente marino ed i detriti plastici rappresentano la
maggior parte dei rifiuti in mare (60 - 90%), diventando una fonte importante di inquinanti. Tra questi,
il di (2-ethylhexyl) ftalato (DEHP) è l'additivo delle plastiche più utilizzato, risultando essere un
contaminante potenzialmente onnipresente in mare. Il DEHP e uno dei suoi principali metaboliti, il
mono (2-etilesil) ftalato (MEHP), sono stati ampiamente studiati negli ultimi decenni, dimostrando
la loro influenza sui processi biochimici sia nell'uomo che nella fauna selvatica. Tuttavia, gli studi sui
loro effetti tossicologici sugli organismi marini sono ancora scarsi, nonostante tali studi possano
rivestire un ruolo fondamentale per sollecitare l’avvio dei provvedimenti necessari per fronteggiare
questa emergenza ambientale. In questo progetto di dottorato, abbiamo studiato gli effetti citotossici,
genotossici e mutageni del DEHP e dell’MEHP, applicando specifici test in vitro, in due linee cellulari
di specie costiere di elevato valore ecologico ed economico, utilizzando una linea cellulate
embrionale di spigola (DLEC) ed una di cute di tursiope (TT); quest'ultima è stata valutata a confronto
con la linea cellulare standardizzata di ovaio di criceto cinese (CHO).
I risultati del DEHP sulle DLEC hanno mostrato una significativa diminuzione della vitalità cellulare
a partire da 0,01 mM dopo 24 ore di trattamento, insieme ad un significativo aumento di apoptosi e
necrosi, a cambiamenti morfologici delle cellule ed a un aumentato distacco cellulare. Il trattamento
con MEHP ha mostrato un leggero effetto negativo sulla vitalità delle DLEC ma nessun effetto
sull'induzione di apoptosi e necrosi a tutte le concentrazioni testate. La maggiore tossicità del DEHP
potrebbe essere attribuita ad un effetto sinergico sia del DEHP che dei suoi metaboliti, che vengono
prodotti dal metabolismo cellulare a partire da quest’ultimo. Inoltre, il trattamento con DEHP ha
portato ad un moderato aumento delle lesioni al DNA a partire da 0,02 mM, mentre l’MEHP non ha
incrementato frammentazione del DNA a nessuna delle concentrazioni testate. Tuttavia, sia il DEHP
che l’MEHP hanno causato un aumento dose-dipendente della frequenza dei micronuclei, considerati
marcatori di danno permanente al DNA, producendo la metà dei micronuclei indotti dall’MEHP,
rispetto al DEHP, alla stessa concentrazione (10 μM). Questi risultati suggeriscono un possibile
effetto aneugenico di questi composti sulla linea cellulare DLEC, probabilmente associato
principalmente all'azione dell’MEHP. I nostri risultati dimostrano che l'esposizione in vitro al DEHP
ha effetti citotossici e genotossici dose-dipendenti nella linea cellulare DLEC, mentre l’MEHP risulta
più pericoloso del suo precursore, poiché induce un'instabilità genomica nella linea cellulare DLEC
senza innescare la morte cellulare.
I risultati sulle linee di mammifero mostrano una riduzione dose-dipendente nella vitalità delle cellule
di TT dopo 24 ore di trattamento a partire dalle dosi basse/intermedie (0.02 e 0.1 mM di DEHP) e un
leggero e non significativo aumento delle cellule necrotiche, fatta eccezione che per la dose di 5 mM,
mentre nelle CHO è stata osservata una significativa diminuzione della vitalità cellulare, insieme ad
un significativo aumento delle cellule necrotiche, a tutte le dosi di DEHP. Sebbene il trattamento con
DEHP di entrambe le linee non abbia incrementato la frammentazione del DNA a nessuna delle
concentrazioni testate, è stato osservato un aumento dose-dipendente della frequenza dei micronuclei,
accompagnato da una progressiva diminuzione della proliferazione cellulare. Questi dati supportano
ulteriormente l'ipotesi che il DEHP potrebbe avere un effetto aneugenico, probabilmente dovuto alla
produzione dei suoi metaboliti, in particolare dell’MEHP.
Inoltre, il confronto di questi ultimi risultati con quelli ottenuti nello studio sulle cellule embrionali
di spigola europea, suggerisce un ordine di tossicità del DEHP come segue: DLEC > CHO > TT.
In conclusione, i risultati dell'intero lavoro sottolineano l'importanza di approfondire lo studio degli
effetti citotossici e genotossici degli ftalati sui sistemi in vitro, soprattutto per le specie protette, e di
intraprendere ulteriori indagini sui loro effetti nei sistemi cellulari in vivo e/o ex vivo di organismi
marini.
Description: 
Dottorato di ricerca in Ecologia e gestione sostenibile delle risorse ambientali
URI: http://hdl.handle.net/2067/43634
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