Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/43528
Title: Animals model to visualise proliferation events in living animals via noninvasive bioluminescence imaging technology
Other Titles: Modelli animali per visualizzare eventi di proliferazione in vivo, attraverso la tecnica non invasiva della Bioluminescenza
Authors: De Latouliére, Luisa
Keywords: Bioluminescence imaging;Zebrafish;Proliferation;Pancreatic ductual adenocarcinoma;Bioluminescenza;Proliferazione;Adenocarcinoma pancreatico duttale;BIO/11
Issue Date: 6-May-2016
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 27. ciclo
Abstract: 
Mouse and Zebrafish models represent a critical step to improve treatments of malignant disease, as an intermediate method of experimentation between cell culture based assays and human clinical trials. Most of the cellular pathways are highly conserved between human, mouse and Zebrafish, thus rendering zebrafish model very attractive. Recently we have generated a transgenic reporter mouse, called MITO-Luc, in which the luciferase reporter gene are placed under the control of cyclinB2 minimal promoter containing three CCAAT boxes tightly regulated by the transcription factor NF-Y. In these mice, BioLuminescence Imaging (BLI) of NF-Y activity visualizes areas of physiological cell proliferation and regeneration during response to injury.
During my PhD thesis I have developed and characterized two pancreatic cancer disease models, MITO-Luc-KC and MITO-Luc-KPC mice, obtained through intercross with our MITO-Luc mouse model with models for pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), LSL-KrasG12D/+;Pdx-1-Cre (KC) and LSL-KrasG12D/+;LSL-Trp53R172H/+;Pdx-1-Cre (KPC) mice. In these models Cre-recombinase regulated by a pancreas-specific promoter activates the expression of oncogenic Kras alone or in combination with a mutant p53, respectively. In these mice we have had the opportunity to follow PDAC evolution in the living animal in a time frame process.
Parallel to the above described mouse models, during my PhD thesis I have also generated a zebrafish model which allows us to visualize through BLI any proliferation events in the context of the entire alive animal during development and adult life. In this transgenic line, luciferase and GFP reporter genes are placed under control of the same proliferation dependent promoter that we have already employed in mice. In these zebrafish model we have observed an ubiquitous GFP and bioluminescence signal in early living embryos while they become tissue specific at 33hpf (hour post fertilization embryos, in juveniles and adult zebrafish animals. To understand if the luciferase activity does occur in proliferating cells we have tested the effect of well-known antiproliferative drugs and treatments, and we have observed that the luciferase activity was inhibited by 5FU and X-Ray on zebrafish embryos. Finally we have analyzed the bioluminescence signal in alive adult Zebrafish after fin clip. We have observed an early systemic proliferation signal in the whole animal, and later a signal focused on the tail regenerating. The use of BLI on our zebrafish model as read out for proliferation events would speed up in the future the evaluation of anti- or pro-proliferative drug candidates.

I modelli animali murini e di Zebrafish sono fondamentali per l’individuazione di nuovi processi molecolari e per lo sviluppo di nuove tecniche d’indagine da applicare alla cura delle principali patologie umane. Difatti sono spesso utilizzati come metodi intermedi di sperimentazione fra i saggi basati sulle colture in vitro e i trial clinici sull’uomo. La maggior parte dei pathways cellulari sono altamente conservati tra uomo, topo e Zebrafish, ciò rende queste modelli molto versatili. Recentemente abbiamo generato un modello transgenico murino, detto MITO-Luc reporter, in cui il gene della luciferasi è posto sotto il controllo di un frammento del promotore della ciclinaB2 contenente tre CCAAT box finemente regolate dal fattore di trascrizione NF-Y. In questi topi, l’analisi della bioluminescenza generata dall’attività di NF-Y, permette di individuare aree di proliferazione cellulare fisiologica e siti di rigenerazione in risposta a danno.
Durante il mio dottorato ho sviluppato e caratterizzato due modelli murini di cancro al pancreas, MITO-Luc-KC e MITO-Luc-KPC, ottenuti in seguito all’incrocio fra il nostro modello murino MITO-Luc con due modelli noti di adenocarcinoma pancreatico duttale: LSL-KrasG12D/+;Pdx-1-Cre (KC) e LSL-KrasG12D/+;LSL-Trp53R172H/+;Pdx-1-Cre (KPC). In questi modelli la ricombinasi Cre è regolata dall’attivazione di un promotore specifico del pancreas che permette l’espressione dell’oncogene Kras da solo nel modello murino KC, o in combinazione con p53 mutata nel modello murino KCP, solo ed esclusivamente nei tessuti pancreatici. Questi nuovi modelli permettono di seguire l’evoluzione dell’adenocarcinoma pancreatico duttale nel singolo animale vivo attraverso sessioni di imaging successive nel tempo.
Parallelamente a questo progetto, durante il dottorato ho generato un modello di Zebrafish che permette di visualizzare, attraverso la tecnica non invasiva della Bioluminescenza eventi di proliferazione nell’animale vivo, sia durante lo sviluppo embrionale che durante la vita adulta. In questa linea transgenica i geni reporter della luciferasi e della GFP sono posti sotto lo stretto controllo dello stesso promotore della ciclinaB2, attivo solo in cellule proliferanti, che avevamo già utilizzato nel modello murino. In questo nuovo modello di Zebrafish, detto MITO-Luc-GFP, l’espressione della GFP e la bioluminescenza risultano essere ubiquitarie in embrioni precoci, e diventano tessuto-specifiche in embrioni di 33 ore, negli avannotti e negli adulti. Per capire se l’attività della luciferasi fosse correlabile con la proliferazione cellulare, abbiamo testato l’effetto di farmaci e trattamenti anti proliferativi e abbiamo osservato che l’attività della luciferasi negli
embrioni MITO-Luc-GFP è inibita dal 5 Fluoro Uracile e dai Raggi X. Inoltre abbiamo osservato il segnale di bioluminescenza in MITO-Luc-GFP adulti generato in seguito al taglio dell’ultima parte della pinna caudale. Dal giorno successivo, al taglio abbiamo osservato un segnale di proliferazione sistemica nell’intero animale e dal secondo giorno, una luce focalizzata precisamente sulla coda in rigenerazione.
L'uso della tecnica non invasiva della Bioluminescenza sul nostro modello di Zebrafish MITO-Luc-GFP, potrebbe, in futuro, accelerare la valutazione di farmaci anti o pro- proliferativi.
Description: 
Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare
URI: http://hdl.handle.net/2067/43528
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