Endocrine disrupting chemicals in the agro-zootechnical environment: transgenic or untransformed cell-based sensoristic technology for early detection

Abstract

Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) are involved in the etiology of metabolic disorders anticipating metabolic syndromes and chronic diseases. The prevention of environmental and dietary exposure to EDCs is therefore crucial in public health. The aim of this PhD study has been to develop different whole cell-based biosensoristic devices for early detection of EDCs in the agro-zootechnical environment, i.e. one of the main interface between humans, animals and environment. To this end, the following sensoristic systems have been designed and developed: i) A fluorimetric sensor based on a transgenic yeast strain for the assessment of the total estrogenic level (linked to the total amount of estrogenic-like Endocrine Active Substances presents in the sample). METHOD: A construct derived from the insertion of the human sequence for an estrogen receptor (GPER) linked to the sequence for a fluorophore (TurboGFP) in a yeast vector (pIB3), with the sequence for a constitutive promoter, was engineered in Pichia pastoris GS115 cells. RESULTS: Molecular analyses on the outcome of the electroporation gave positive results, however fluorescence measurements did not show Turbo-GFP-related spectra. Assuming that a misfolding of chimeric protein has been occurred, Turbo-GFP was substitute with mCherry (an easier-to-fold protein that turns the medium red). The recombination reaction was successfully used and the obtained plasmid was engineered in P. pastoris cells. Red positive colonies were cultured to analyze cell pellet and cellular extracts fluorescence: mCherry-related spectra were observed and samples extracted with a detergent had fluorescence values 6.7X higher than samples extracted without detergent. The next step will be biomediator testing by fluorescent spectral analyses using 17β-estradiol as a model chemical. ii) An amperometric sensor based on an untransformed yeast strain to detect herbicide simazine (with known endocrine disrupting properties). This sensor was then applied to spiked agricultural water and raw cow’s milk samples. METHOD: Percentage interference (%ρ) caused to aerobic cellular respiration of Saccharomyces cerevisiae suspensions was assessed by measurements of oxygen consumption of cell suspensions exposed to the herbicide compared with controls (not exposed suspensions). Considering the European residue limits in drinking water (0.1ppb) and cow’s milk (10ppb), various concentrations were tested. RESULTS: The results obtained from short-term (3h) tests showed that the biosensoristic device is able to detect the presence of simazine, without any sample pretreatments, up to concentrations 5 times below the EU legal concentration limit for both the matrices. Cellular respiratory inhibition (%ρ>0) was found at 2ppb in milk samples and at 0.02 and 0.2ppb in agricultural water samples; cellular respiratory hyperstimulation over the maximum physiological rate (%ρ<0) was found at 200ppb in milk samples and at 0.1ppb in water samples. From these results we hypothesized a dose-dependent combination effect between three different cellular mechanisms triggered by the presence of simazine. iii) Two fluorimetric sensors based on an untransformed algal strain to detect the herbicide diuron (with known endocrine disrupting properties). a) METHOD: The sensor exploited the variation of selected parameters in Kautsky curves measured from dark-adapted Chlamydomonas reinhardtii cells as toxicological endpoint. In particular inhibition of photosynthesis by diuron leads to an increase in the fluorescence yield at the J transient in the Kautsky curve. In our experimental conditions, fluorescence at 8ms were considered, as they are less variable than data at 2ms. Relative variable fluorescence at 8ms (V8ms), and a normalized effect index (ε%) which compares V8ms in blank samples (V8msblk) and in exposed samples (V8msexp) values were analyzed. RESULTS: At 2ppb of diuron V8msexp values were significantly higher than V8msblk; at 0.02ppb V8msblk values were significantly higher than V8msexp; at 0.2ppb significant differences were not found. ε% shows an inhibition effect at 2ppb; a null effect at 0.2ppb; a presumptive hormetic-like effect at 0.02ppb. b) METHOD: The sensor exploited the two chlorophyll fluorescence maxima (684 and 735nm) as toxicological endpoint. RESULTS: In presence of diuron fluorescence values incremented similarly in both maxima thus it was considered only the fluorescence at 684nm. The normalized parameter analyzed was the percentage increase (%ι) in F684nm. The assay proved to be able to detect herbicide diuron till 0.2ppb. In conclusion, all the tested whole cells biosensoristic devices proved to be suitable for the prefixed aims. Through further improvement such devices and relating bioassays could represent a new technological opportunity for future applications in monitoring at critical control points including agro-zootechnical environment.

Gli interferenti endocrini (IE) sono coinvolti nell’eziologia di disordini metabolici che possono preannunciare sindromi metaboliche e malattie croniche. Prevenire l’esposizione ambientale e alimentare agli IE è quindi cruciale per la salute pubblica. Lo scopo di questo progetto di tesi di Dottorato è stato quello di sviluppare differenti dispositivi biosensoristici a cellula intera per il rilevamento precoce di IE nell’ambiente agro-zootecnico, cioè una delle principali interfacce tra esseri umani, animali e ambiente. A tale fine sono stati progettatti e realizzati i seguenti sistemi sensoristici: i) un sensore fluorimetrico basato su un ceppo transgenico di lievito per la valutazione del livello estrogenico totale (legato alla quantità totale di sostanze attive a livello endocrino con attività simil-estrogenica presenti nel campione). METODO: Un costrutto derivato dall’inserzione della sequenza umana per un recettore estrogenico (GPER) legata a quella per un fluoroforo (TurboGFP) in un vettore di lievito (pIB3) contenente la sequenza per un promotore costitutivo è stato ingegnerizzato in cellule di Pichia pastoris GS115. RISULTATI: Le analisi molecolari effettuate sulle cellule elettroporate hanno dato risultati positivi, ma le misure di fluorescenza non hanno mostrato spettri correlabili alla Turbo-GFP. Supponendo che si sia verificato un misfolding della proteina chimerica, il fluoroforo Turbo-GFP è stato sostituito con mCherry (una proteina con folding più semplice e in grado di conferire una colorazione rossa al mezzo di coltura). La ricombinazione è stata usata con successo e il nuovo plasmide ottenuto è stato ingegnerizzato nelle cellule di P. pastoris. Le colonie positive rosse sono state quindi coltivate per analizzare il segnale di fluorescenza del pellet cellulare e degli estratti cellulari. Sono stati così osservati spettri correlabili all’mCherry e i valori di fluorescenza degli estratti cellulari in presenza di detergente erano 6,7 volte più alti di quelli ottenuti in assenza di esso. Il passo successivo sarà il testing del biomediatore attraverso analisi di fluorescenza in condizioni di esposizione al 17β-estradiolo, usato come molecola modello. ii) un sensore amperometrico basato su un ceppo non trasformato di lievito per la rilevazione dell’erbicida simazina (con note proprietà di interferenza endocrina). Il sensore è stato quindi utilizzato su campioni di acqua per uso agricolo e di latte vaccino crudo fortificati con simazina. METODO: L’interferenza percentuale (%ρ) causata alla respirazione aerobica cellulare di sospensioni di Saccharomyces cerevisiae è stata valutata attraverso misure del consumo di ossigeno da parte di sospensioni cellulari esposte all’erbicida rispetto al controllo (sospensioni cellulari non esposte). Sono state testate varie concentrazioni di erbicida, considerando i livelli massimi di residui stabiliti dall’Unione Europea per l’acqua potabile (0,1ppb) e per il latte vaccino (10ppb). RISULTATI: I risultati ottenuti da esperimenti di esposizione a breve termine (3h) hanno mostrato come il dispositivo biosensoristico sia in grado di rilevare la presenza di simazina, senza la necessità di pretrattamenti del campione, fino a concentrazioni 5 volte sotto i limiti di legge europei in entrambe le matrici utilizzate. A 2 ppb nei campioni di latte e a 0,02 e 0,2 ppb nei campioni di acqua per uso agricolo si è evidenziata un’inibizione della respirazione cellulare (%ρ>0); a 200ppb nei campioni di latte e a 0,1 ppb nei campioni di acqua si è invece evidenziata una iperstimolazione della respirazione cellulare oltre il massimo valore fisiologico (%ρ<0). Sulla base di questi risultati è stato ipotizzato un effetto di combinazione (dose-dipendente) tra tre diversi meccanismi cellulari innescati dalla presenza di simazina. iii) Due sensori fluorimetrici basati su un ceppo non trasformato di alga unicellulare per la rilevazione dell’erbicida diuron (con note proprietà di interferenza endocrina). a) METODO: Il sensore sfrutta come endpoint tossicologico la variazione dei parametri selezionati dalla curva di Kautsky misurata su cellule di Chlamydomonas reinhardtii adattate al buio. In particolare l'inibizione della fotosintesi da parte del diuron determina un incremento della resa di fluorescenza al punto J della curva di Kautsky. Nelle nostre condizioni sperimentali, sono stati considerati i dati di fluorescenza ottenuti a 8ms, in quanto essi erano meno variabili di quelli ottenuti a 2ms. Sono stati analizzati il parametro di variazione relativa di fluorescenza a 8ms (V8ms) e un indice di effetto normalizzato (ε%) che confronta i valori di V8ms nei campioni controllo (V8msblk) ed in quelli esposti (V8msexp). RISULTATI: A 2ppb di diuron i valori di V8msexp erano significativamente più alti di quelli di V8msblk; a 0.02ppb i valori di V8msblk erano significativamente più alti di quelli di V8msexp; a 0.2ppb non sono state trovate differenze significative. ε% mostra un effetto di inibizione a 2ppb; nessun effetto a 0.2ppb; un presunto effetto simil-ormetico a 0.02ppb. b) METODO: Il sensore sfrutta come endpoint tossicologico i due massimi dello spettro di fluorescenza della clorofilla (684 and 735nm). RISULTATI: In presenza di diuron i valori di fluorescenza hanno mostrato incrementi simili per entrambi i massimi dello spettro ed è stata dunque considerata solo la fluorescenza a 684nm. Il parametro normalizzato analizzato è stato l’incremento percentuale (%ι) di F684nm. Il biosaggio sviluppato si è dimostrato utile per la rilevazione dell’erbicida diuron fino a 0.2ppb. In conclusione, tutti i dispositivi biosensoristici a cellule intere testati si sono dimostrati adatti agli scopi prefissati. Attraverso ulteriori miglioramenti tali dispositivi e relativi biosaggi potrebbero rappresentare una nuova opportunità tecnologica per le future applicazioni nel monitoraggio in punti critici di controllo, compreso l'ambiente agro-zootecnico.