Marcatori del latte per lo studio delle infiammazioni intramammarie nella bovina da latte

Abstract

Il raggiungimento di alti livelli di produzione in zootecnia ha determinato una maggiore difficoltà degli animali ad adattarsi all’ambiente. Questo si è tradotto in un aumento dei tassi di rimonta, una minore longevità, una maggiore frequenza di malattie variegate e multifattoriali, con un conseguente maggior uso di farmaci veterinari. Nel caso delle bovine da latte l’insorgenza di malattie condizionate è facilitata dalla presenza di fenotipi animali ad alta produzione che richiedono elevate competenze tecniche e gestionali, strutture adeguate e controlli intensivi dell’allevatore, in rapporto ad una ridotta capacità di adattamento a condizioni sub-ottimali dell’ambiente. Nel periodo di transizione si verificano importanti cambiamenti fisiologici, metabolici, immunologici e nutrizionali che mostrano un legame con l’eventuale sviluppo di patologie cliniche e subcliniche nel post-parto e un effetto di lunga durata sulle performances produttive e riproduttive dell’intera lattazione. Il rischio è elevato tanto per le forme tipiche del periparto (ritenzione di placenta, collasso puerperale, acetonemia o chetosi primaria, steatosi epatica, metrite, dislocazione abomasale), quanto per le altre affezioni (mastiti, zoppie, turbe intestinali, virosi ecc.). Si stima che il 75% delle affezioni metaboliche e infettive delle bovine da latte si verifichi nel primo mese di lattazione e che il 50% delle lattazioni sia associato ad almeno una dismetabolia nel periparto. Nel periodo di transizione dunque, la maggior parte delle bovine è facilmente colpita da affezioni e ne deriva quindi che la prevenzione delle affezioni è la strada per il successo dell’intera lattazione e della carriera produttiva della lattifera. Lo scopo generale della presente tesi è stato quello di studiare le associazioni tra alcune caratteristiche fenotipiche del latte, sia di tipo tradizionale sia di tipo innovativo, con la conta delle cellule somatiche del latte, per stimare la possibilità di utilizzare questi parametri per valutare lo stato di salute della ghiandola mammaria. Più in particolare, il fine ultimo della presente ricerca è stato l’identificazione di potenziali biomarkers, che possano promuovere la diagnosi precoce e quindi la prevenzione di patologie, fornendo agli allevatori nuovi strumenti per una gestione efficiente e per una migliore produttività. L'infiammazione intramammaria (IMI), accompagnata da cambiamenti immunologici e patologici nel tessuto mammario, può sviluppare infatti una vasta gamma di conseguenze sulla qualità fisica, chimica e spesso microbiologica del latte. Lo studio è stato effettuato su vacche Frisone allevate presso un’azienda sperimentale ed è consistito in due esperimenti paralleli. Nella prima prova è stata considerata l’intera mandria di 45 vacche e sono stati analizzati parametri tradizionali, come il profilo acidico, il contenuto dei minerali e alcuni metaboliti (acetone, citrati e β-idrossibutirrato (BHB)) con un metodo predittivo e high throughput (la spettroscopia del medio infrarosso: MIR) e parametri innovativi quali il profilo della N-glicosilazione dell’immunoglobulina G con la ultra cromatografia liquida ad alte prestazioni. Nella seconda prova sono stati determinati, su 17 bovine della stessa mandria, alcuni parametri tradizionalmente studiati nel latte (BHB, isocitrato, urea, glucosio-6-fosfato, glucosio, conta delle cellule somatiche (SCC), L-lattato deidrogenasi e NAGasi) e l’espressione genica nelle cellule somatiche del gene dell’IL-8, della L- selectina e della gelsolina, tutti geni coinvolti nella risposta immunitaria dell’ospite. Durante le prime fasi dell'infiammazione, il sistema vascolare esprime diverse citochine proinfiammatorie chemiotattiche, tra cui l’IL-8, e diverse molecole di adesione, come L-selectina, che promuovono l'aderenza dei leucociti e il reclutamento di citochine aggiuntive nei tessuti sottostanti. La gelsolina è un actin binding protein, che, rimodellando l’actina del citoscheletro, regola la migrazione cellulare e i movimenti della membrana cellulare, come la fagocitosi. Nel primo esperimento l’analisi multivariata dei parametri misurati nei campioni di latte, suddivisi in tre gruppi in base alla SCC, ha evidenziato che due acidi (C16:0 e C18:2 c9c12), gli ω6 e due minerali (sodio e potassio) possono essere considerati come indicatori di IMI. Tramite la tecnica MIR, tali parametri sono rapidi da identificare ed, in futuro, quindi applicabili anche online nelle sale di mungitura, permettendo agli allevatori di monitorare lo stato di salute degli animali e di intervenire in tempo reale. Il secondo esperimento ha mostrato come l’espressione della gelsolina possa essere un buon predittore dei cambiamenti delle concentrazioni di LDH, NAGasi, grasso e della conta somatica cellulare nel latte, quindi un buon indicatore dello stato di salute della mammella e della presenza di infiammazioni in corso. Il passo successivo dovrebbe essere uno studio di associazione (fenotipi - alleli) come la GWAS per ricercare i meccanismi di difesa e i polimorfismi genici che possano alterare la risposta dell’animale. In futuro sarà necessario sempre più ridurre le infiammazioni, conservando un buona difesa immunitaria per selezionare animali meno suscettibili sia alle malattie che alla risposta infiammatoria.

For several decades, breeding goals in dairy cattle focused on increased milk production. Herd management has been challenged to compensate and to balance fertility, udder health and metabolic diseases against increased production to maximize profit without compromising welfare. Functional traits, such as direct information on cow health, have also become more important because of growing concern about animal well-being and consumer demands for healthy and natural products. There are major concerns about the impact of drugs used in veterinary medicine on the spread of antibiotic-resistant strains of bacteria that can negatively impact human health. Sustainability and efficiency are also increasingly important because of the growing competition for high-quality. During transition period dairy cattle undergo physiological changes (i.e. hormonal and immune dysregulation) due to the lactation onset, that easily lead to an increase of metabolic and infectious diseases. Consequently, in this period dairy cows are most susceptible to developing common peripartum diseases (retained placenta, metritis, endometritis, ketosis, displaced abomasum, mastitis, lameness, Johne’s disease, leukosis, salmonellosis, abortion). Approximately 75% of disease in dairy cows typically happens in the first month after calving. It is difficult to overstate the crucial role of the transition period in dairy cow health and performance throughout lactation. The general aim of this study is, firstly, to study association of some traditional and some innovative phenotypical features of bovine milk with somatic cell count (SCC) and then, to exploit them, for assessing the health status of mammary gland. In particular, the main purpose of this research was the identification of potential and sensitive milk biomarkers to promote an early detection and consequently mastitis prevention, by providing to breeders new tools for an efficient management and an optimal production efficiency. Depending on different degrees of intensities, the intramammary inflammation (IMI) leads to immunological and pathological changes in the mammary tissue and to a wide range of consequences regarding physical, chemical, and often microbiological alterations of secreted milk. This study was carried out on Holstein cows, reared at an experimental farm and divided into two parallel trials. In the first one, a herd of 45 cows was monitored in the tree weeks postpartum. Milk samples were collected to analyse traditional parameters, as fatty acid profile, mineral component and some metabolites (acetone, citrates and β-hydroxybutyrate (BHBA)) by a predictive and high throughput technology, Fourier transform mid-infrared (FT-MIR) spectrometry, and an innovative parameter, glycans on the IgG fraction of milk, by ULPC (ultra-high pressure liquid chromatography). In the second trial milk metabolic parameters (BHBA, isocitrate, urea, uric acid, glucose-6-phosphate and free glucose), conventional inflammatory biomarkers (SCC, lactate dehydrogenase (LDH), N-acetyl-β-d-glucosaminidase (NAGase)) were quantified and IL8, L selectin and gelsolin gene expression were measured in somatic cells. This second trial was carried out on samples relative to only 17 out of the 45 cows. At the early inflammatory response, vascular system expresses several proinflammatory cytokines (i.e. IL8) and various adhesion molecules (i.e. L-selectin), to facilitate the migration of leukocytes from the blood to the site of injury. Gelsolin is an actin binding protein, remodelling actin cytoskeleton and controlling cell morphology, migration, invasion, and movement of the cell membrane, as phagocytosis. In the first experiment milk samples were classified into 3 groups, based on SCC. Canonical discriminant analysis showed that two fatty acids (palmitic and α linoleic acid), ω6 and two minerals (sodium and potassium) could be considered as indicator of IMI. By FT-MIR spectrometry, which allows fast and non-destructive predictions of milk composition, these parameters could be online analysed consenting breeders to monitor health status and to take action in real time. Finally in the second experiment it was highlighted as gelsolin expression could be a good predictor of mammary gland health status and of ongoing inflammation, being correlated with LDH, NAGase and SCC. The next step should be allele-phenotype association studies, especially genome-wide association studies (GWAS), to search for such potential common defence mechanisms (innate immunity) and different genetic mechanisms (gene polymorphisms) existing in dairy cows which alter their responses to invading pathogens within the mammary gland. In the future, ways to reduce inflammation while maintaining a good immune defence must be developed and ideally, cows with a lower susceptibility to both diseases and inflammation be selected.