Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/43471
Title: Reinforcing and broadening wheat resistance against Fusarium diseases by a barley deoxynivalenol detoxifying UDP-glucosyltransferase and its pyramiding with ectopic glycosidase inhibitors
Other Titles: Rafforzamento e ampliamento della resistenza del frumento a malattie causate da Fusarium tramite una UDP-glucosiltransferasi d'orzo capace di detossificare il deossinivalenolo e riparazione con inibitori di glicosidasi ectopiche
Authors: Mandalà, Giulia
Keywords: FHB;FCR;Transgenic plants;HvUGT13248;DON-detoxification;Gene pyramiding;Piante transgeniche;Detossificazione del DON;Piramidazione genica;BIO/04
Issue Date: 24-Apr-2018
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 30. ciclo
Abstract: 
Fusarium diseases, including Fusarium head blight (FHB) and Fusarium crown rot (FCR) represent major agricultural problems worldwide, causing reduction of grain yield and quality and food safety. The latter issue is associated with grain contamination by mycotoxins, particularly deoxynivalenol (DON), responsible for health problems in humans and animals. DON is a protein synthesis inhibitor, acting as a virulence factor during pathogenesis. DON glycosylation, forming DON-3-β-D-glucoside (D3G) by specific UDP-glucosyltransferases (UGTs), is the main mechanism involved in enhancing plant tolerance to DON. Improvement of FHB resistance is a major target in both bread and durum wheat, the latter being especially vulnerable, as effective resistance sources are particularly limited. Previous studies demonstrated that the expression of the barley HvUGT13248 gene confers resistance to FHB in bread wheat (Li et al. 2015, MPMI 28:1237-46), reducing disease symptoms of almost 60% as compared to control plants.
To highlight DON-detoxification potential in FHB control, we produced transgenic durum wheat plants constitutively expressing the HvUGT13248 gene (Ubi-UGT) and bread wheat plants expressing it in flower tissues (Lem-UGT). Transgenic plants were used in infection experiments with F. graminearum for evaluating FHB severity, as compared to wild-type plants. Our results showed that the HvUGT13248 gene determines in durum wheat Ubi-UGT plants a significant reduction of FHB symptoms (up to 30%) during early to mid stages of infection progress. Notably, Ubi-UGT plants showed much higher DON-to-D3G conversion ability (100x D3G/DON ratio) and a considerably reduced total DON content in semolina. Lem-UGT bread wheat plants also showed reduction of FHB severity. In particular, the floral-specific expression highlighted a dose-dependent efficacy of the UGT detoxification mechanism. Indeed, two transgenic lines with different levels of transcript expression showed that, while the higher expressing line determined a significant reduction of FHB symptoms (up to 40%) at all infection stages, only a slight reduction of FHB severity was observed in the lower expressing line, as compared to non-transgenic plants. Although DON-to-D3G conversion increased (10x) in transgenic plants, total DON in flours resulted not different or even higher than the control. This possibly reflects the importance of timing and control of transgene expression in toxin detoxification and thus in restraining DON production. In addition, we verified for the first time the possible involvement of the DON-detoxifying approach in limiting FCR disease induced by F. culmorum. When challenged with the pathogen at the seedling stage, Ubi-UGT durum wheat plants demonstrated significant reduction of almost 50% of FCR symptoms throughout the infection timing, as compared to non-transgenic plants. This result represents the first report of FCR resistance improvement associated with overexpression of an UGT involved in DON-detoxification. Finally, in order to investigate if the combination of different mechanisms could further improve Fusarium disease resistance, we stacked transgenes controlling the DON-to-D3G conversion and the inhibition of cell wall degrading enzymes by glycosidase inhibitors in the same wheat genotype. To this aim, in the cross progeny of separate transgenic lines, durum wheat UGT+PMEI and bread wheat UGT+PGIP double-transgenic genotypes were selected. UGT+PMEI plants constitutively express the genes HvUGT13248 and AcPMEI, coding for a kiwi pectin methylesterase inhibitor. UGT+PGIP plants express in floral tissues the HvUGT13248 gene and constitutively the PvPGIP2 gene, coding for a bean polygalacturonase inhibiting protein. The PMEI contribution in UGT+PMEI plants resulted ineffective against FCR disease, the double-transgenic seedlings exhibiting similar level of symptom reduction to the UGT single transgenic line. On the other hand, both UGT+PMEI and UGT+PGIP plants exhibited increased resistance against FHB, further reducing FHB symptoms during infection, as compared to the separate transgenic lines.
In conclusion, our results demonstrate that DON-detoxification confers a broad-spectrum resistance against DON-producing fungi. Moreover, pyramiding genes controlling different resistance mechanisms can further reinforce the host response. This approach may be particularly attracting for breeding programs aimed at improving and broadening the plant reaction to pathogen attacks in a sustainable manner.

Le malattie causate dai funghi del genere Fusarium, comunemente chiamate fusariosi, includono la fusariosi della spiga (FHB) e il marciume del colletto (FCR). Le fusariosi rappresentano uno dei maggiori problemi in agricoltura a livello mondiale, in quanto causano sia una riduzione della resa e della qualità della granella, sia problemi di sicurezza alimentare. Quest’ultimi sono associati soprattutto alla contaminazione dei semi da parte di micotossine, principalmente deossinivalenolo (DON), responsabile di problemi alla salute umana e animale. Il DON è un inibitore della sintesi proteica che agisce inoltre come fattore di virulenza nella patogenesi. Il meccanismo principale per aumentare la tolleranza della pianta al DON è considerato la detossificazione mediante glicosilazione, effettuata da specifiche UDP-glucosiltransferasi (UGT) che portano alla formazione della molecola D3G (DON-3-β-D glucoside). Il miglioramento della resistenza alla FHB è uno dei principali obiettivi sia per il frumento tenero che per il frumento duro; quest’ultimo risulta particolarmente vulnerabile in quanto risorse naturali di resistenza sono decisamente limitate. È stato dimostrato in studi precedenti (Li et al. 2015, MPMI 28:1237-46) che l’espressione costitutiva in frumento tenero del gene HvUGT13248 di orzo conferisca resistenza alla FHB, riducendo i sintomi tipici della malattia circa del 60% rispetto alle piante controllo.
Al fine di mettere in luce le potenziali proprietà della detossificazione del DON nel miglioramento della resistenza alla FHB, in questo lavoro sono state prodotte delle piante transgeniche sia di frumento duro, esprimenti in maniera costitutiva il gene HvUGT13248 (piante Ubi-UGT), sia di frumento tenero, esprimenti lo stesso gene nei tessuti fiorali (piante Lem-UGT). Le prime sono state inizialmente utilizzate per valutare la sintomatologia di FHB rispetto alle piante non transgeniche, dopo infezione col fungo F. graminearum. I risultati ottenuti mostrano una significativa riduzione dei sintomi (fino al 30%) durante gli stadi iniziali ed intermedi della progressione dell’infezione e inoltre le piante Ubi-UGT hanno dimostrato non solo una notevole capacità di conversione del DON in D3G (rapporto D3G/DON in farine aumentato di 100 volte), ma anche un significativo abbassamento del contenuto totale di DON nella semola. Anche le piante di frumento tenero Lem-UGT hanno mostrato una riduzione dei sintomi di FHB, evidenziando inoltre un’efficacia del meccanismo di detossificazione di tipo dose-dipendente. Infatti, in questo caso le due linee transgeniche utilizzate mostravano livelli di espressione dell’UGT ectopica differenti e, mentre la linea con maggiore espressione ha ridotto fino al 40% la sintomatologia di FHB rispetto al controllo non transgenico durante tutte le fasi di infezione, la linea che mostrava un minore livello di espressione l’ha ridotta solo parzialmente e solo in alcuni stadi. In entrambi i casi, nelle linee transgeniche la conversione del DON in D3G è risultata notevolmente aumentata (circa 10 volte) ma il contenuto totale di DON nelle farine non è risultato differente rispetto alle farine derivate dalle piante non transgeniche, possibilmente riflettendo l’importanza del controllo e della tempistica di espressione del transgene per detossificare la micotossina al fine di contenerne efficacemente la produzione. Inoltre, per la prima volta in questo lavoro è stato valutato il possibile coinvolgimento del meccanismo di detossificazione del DON per limitare la FCR causata dal fungo F. culmorum. A tal fine, le piante Ubi-UGT di frumento duro sono state infettate col suddetto fungo allo stadio di plantule, dimostrando una riduzione circa del 50% dei sintomi di FCR durante tutti gli stadi dell’infezione. Questo lavoro costituisce dunque la prima osservazione del coinvolgimento della detossificazione del DON ad opera di UGT, associato al miglioramento della resistenza alla malattia FCR. Infine, allo scopo di valutare se la combinazione di meccanismi di difesa differenti potessero ulteriormente migliorare la resistenza alle fusariosi, abbiamo combinato nello stesso genotipo transgeni coinvolti nella conversione del DON in D3G e nell’inibizione degli enzimi fungini che degradano la parete cellulare, tramite inibitori delle glicosidasi. A questo scopo sono state incrociate differenti linee con singoli transgeni, ottenendo genotipi con i doppi transgeni UGT+PMEI in frumento duro, e UGT+PGIP in frumento tenero. In particolare, le piante UGT+PMEI esprimono costitutivamente i geni HvUGT13248 e AcPMEI (un inibitore di kiwi delle pectin metil esterasi), mentre le piante UGT+PGIP esprimono i geni HvUGT13248 e PvPGIP2 (un inibitore di fagiolo delle poligalatturonasi), rispettivamente nei tessuti fiorali e in maniera costitutiva. I risultati delle analisi di infezione hanno mostrato che la PMEI non è efficace nel contrastare la malattia FCR in quanto le piante UGT+PMEI presentano livelli di resistenza simili alla linea parentale Ubi-UGT. D’altra parte, entrambi i genotipi con doppi transgeni UGT+PMEI e UGT+PGIP hanno invece dimostrato una resistenza alla malattia FHB superiore rispetto alle linee parentale con singoli transgeni. In conclusione, i risultati ottenuti dimostrano sia che la detossificazione del DON può conferire un ampio spettro di resistenza contro funghi che producono questa micotossina, che la piramidazione di geni coinvolti in meccanismi di resistenza differenza può ulteriormente contribuire nel migliorare la risposta dell’ospite. Questi approcci possono inoltre essere particolarmente interessanti per programmi di miglioramento genetico volti, in maniera sostenibile, all’incremento e all’ampliamento dello spettro di resistenza a diversi patogeni.
Description: 
Dottorato di ricerca in Scienze delle produzioni vegetali e animali
URI: http://hdl.handle.net/2067/43471
Appears in Collections:Archivio delle tesi di dottorato di ricerca

Files in This Item:
File Description SizeFormat
gmandala_tesid.pdf4.16 MBAdobe PDFView/Open
Show full item record

Page view(s)

50
Last Week
0
Last month
0
checked on Mar 27, 2024

Download(s)

216
checked on Mar 27, 2024

Google ScholarTM

Check


All documents in the "Unitus Open Access" community are published as open access.
All documents in the community "Prodotti della Ricerca" are restricted access unless otherwise indicated for specific documents