Development of isothermal detection methodology for Plasmopara viticola and Phytophthora infestans

Abstract

This research concerns the development and application of isothermal amplification detection techniques to two important plant pathogenic Oomycete: Plasmopara viticola causing grapevine downy mildew and Phytophthora infestans, the causal agent of potato late blight. Real-time Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay was applied for the early detection of P. viticola from infected grapevine plants. A rapid crude plant extract (CPE) preparation method from infected leaves was developed for on-site testing. The LAMP assay targeting the large ribosomal subunit gene (LSU) was specific to P. viticola and sensitive to 10 sporangia/ml. In the inoculation experiments of greenhouse plants and leaf discs samples, LSU primers detected downy mildew infections at a concentration of 103 sporangia/ml after 24h of inoculation. In addition, Real-time LAMP and Recombinase Polymerase Amplification (RPA) assays were developed targeting the ITS2 region of the ribosomal DNA of P. infestans. Both LAMP and RPA assays showed specificity to P. infestans and the closely related species P. andina, P. mirabilis, P. phaseoli and P. ipomoeae. No cross-reaction occurred with the potato pathogens tested. LAMP and RPA assays detected DNA at 50 fg/ul and showed to be insensitive to CPE inhibition. The isothermal assays were validated with inoculated potato plants using a portable Smart-DART device. The LAMP and RPA assays effectively detected P. infestans DNA in symptomless leaf tissue 24 h and 72 h post-inoculation, respectively. Finally, the suitability of the latter LAMP assay was tested for a rapid detection and quantification of airborne inoculum of P. infestans. Standard curves of P. infestans sporangia and ITS2 copy were constructed. The quantitative LAMP (qLAMP) assay was validated in the laboratory with silicon-coated rods containing a known number of sporangia. The analysis was performed using a regression procedure. A linear relationship between the number of sporangia deposited onto the rods estimated with microscopy and the number of sporangia estimated with the qLAMP assay was obtained. A rapid and accurate on-site detection of P. infestans and P. viticola in plant material and spore samplers will contribute to improved disease diagnosis, early detection of first infections and facilitate prompt management decisions.

La ricerca svolta riguarda lo sviluppo e l’applicazione di tecniche di amplificazione isotermica per il rilevamento di due importanti oomyceti fitopatogeni: Plasmopara viticola, agente causale della peronospora della vite e Phytophthora infestans, agente causale della peronospora della patata. Per il rilevamento precoce di P. viticola in piante di vite infette, é stata utilizzata la tecnica Real-time Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP). Per il saggio in campo, é stato sviluppato un metodo di preparazione rapida di un estratto di pianta crudo (CPE) a partire da foglie infette. Il saggio LAMP é stato specifico per il gene per la sub-unità ribosomiale (LSU) di P. viticola, e sensibile a 10 sporangi/ml. Negli esperimenti di inoculazione su piante in serra e su dischi fogliari campionati, i primers LSU sono stati in grado di rilevare infezioni di peronospora a concentrazioni di 103 sporangi/ml dopo 24 ore dall’inoculazione. Inoltre, saggi di Real-time LAMP e Recombinase Polymerase Amplification (RPA) sono stati sviluppati per il rilevamento della regione ITS2 del DNA ribosomiale di P. infestans. Entrambi i saggi LAMP e RPA hanno dimostrato specificità per P. infestans e per le specie strettamente correlate P. andina, P. mirabilis, P. phaseoli e P. ipomoeae. Non sono state rilevate reazioni incrociate con gli altri patogeni della patata saggiati. I saggi LAMP e RPA hanno rilevato DNA a 50 fg/ul e non hanno mostrato alcuna inibizione al CPE. I saggi isotermici sono stati validati con piante di patate inoculate utilizzando uno strumento portatile Smart-DART. I saggi LAMP e RPA hanno rilevato DNA di P. infestans nei tessuti fogliari di piante asintomatiche a 24 e 72 ore dall’inoculazione, rispettivamente. In fine, l’utilizzo del saggio LAMP è stato testato per il rapido rilevamento e quantificazione dell’inoculo airborne di P. infestans. Sono state ottenute le curve standard degli sporangi e del numero di copie ITS2 di P. infestans. Il saggio LAMP quantitativo (qLAMP) è stato validato in laboratorio con barrette rivestite di silicone contenenti un numero noto di sporangi. L'analisi è stata effettuata tramite regressione lineare, con cui è stata ottenuta una relazione lineare tra il numero di sporangi presenti sulle barrette, valutato mediante conteggi al microscopio, e il numero di sporangi stimato dal saggio qLAMP. Un rapido e accurato rilevamento in campo di P. infestans e P. viticola contribuirà a migliorare la diagnosi delle malattie, il rilevamento precoce delle prime infezioni e a facilitare le decisioni per una gestione tempestiva.