Investigations on the transmission of the bacterium Xylella fastidiosa by insect vectors

Abstract

The quick dissemination of Xylella fastidiosa in olive trees in the province of Lecce (southern Italy) prompted an investigation to identify the local insects which are likely to be involved in the transmission of the bacterium, to study their seasonal dynamics and to evaluate their role in the disease epidemiology. The study focused on the Auchenorrhyncha species (sharpshooter leafhoppers and froghoppers or spittlebugs), a group that includes known vectors of X. fastidiosa. Adults of these species were monthly sampled over a two years period from four severely infected Apulian olive groves. Fifteen Auchenorrhyncha species were captured and identified in that area, in three of them, i.e. Philaenus spumarius, Neophilaenus campestris and Euscelis lineolatus, X. fastidiosa was detected by PCR. This study revealed that adults of P. spumarius, already known vector of the bacterium, are greatly dominant compared to the other species. Most of the captured species were abundant in summer and their adults appear in March-April, except for E. lineolatus that overwinters as adult. Transstadial or transovarial transmission was excluded since no Xf-positive insect sample was never found in adults of the new generations of the three species. According to these findings and considering the lack of latent period for X. fastidiosa transmission, preventive control measures against juvenile forms of the vector P. spumarius should be recommended from late March to mid-April until demonstrating the transmission ability of the other two species. From another hand, an evaluation of the possibility to utilize the Xf-positive insects found in the buffer zones (so called “Spy Insects”) as indicators of the presence of the bacterium in apparently uncontaminated areas, was carried out. From May to June 2014, insects were collected from a designed buffer zone in a punctiform Xf-infected area. The bacterium was successfully detected by PCR in the same 3 out of 6 species of Auchenorrhyncha captured. Infected adults of these species were detected throughout the buffer zone at a distance of 1 Km far from the infection site. Therefore, adults of these three species have an important role as “Spy insects” to early reveal the presence of the pathogen in apparently free areas before symptoms become visible on the plants. Finally, X. fastidiosa contain endoglucanases in its genome. These enzymes cleave the β-1,4 glycosidic linkages composing the exopolysaccharides matrix protecting bacterial biofilms. Once acquired, X. fastidiosa multiply and colonizes the insect foregut by forming biofilms. We speculated that the endoglucanases may contribute in biofilm dissolution and interrupt vector transmission of the bacterium as a biological control measure. For this, we tested the acquisition, retention and transmission of a X. fastidiosa endoglucanases minus mutant by an efficient vector. In order to explore this effect, we conducted a laboratory-based transmission assays with artificial feeding sachets and results were obtained through quantitative PCR and scanning electron microscopy. It was shown that endoglucanases modulate bacterial adhesion to the insect cuticule over time and consequently affect the retention period of X. fastidiosa.

La rapida diffusione della Xylella fastidiosa nella provincia di Lecce ha reso necessario lo svolgimento di una ricerca sugli insetti potenzialmente coinvolti nella trasmissione del batterio (vettori). Tale indagine ha interessato sia l’individuazione degli insetti “potenziali vettori” , sia lo studio delle loro dinamiche stagionali e ruolo nella diffusione del patogeno. La ricerca si è concentrata sull’ordine degli Auchenorrinchi che include insetti già noti come vettori di X. fastidiosa. Le catture delle forme adulte sono state effettuate con cadenza mensile in quattro oliveti infettati da X. fastidiosa. Nelle aree oggetto di indagine sono state identificate quindici specie diverse di insetti appartenenti all’ordine degli Auchenorrinchi, di cui solo tre specie, ovvero Philaenus spumarius, Neophilaenus campestris ed Euscelis lineolatus hanno dimostrato la capacità di acquisire X. fastidiosa attraverso i saggi molecolari (PCR). Nelle stesse aree è stato rilevato che le popolazioni adulte di P. spumarius, già noto vettore del batterio, sono notevolmente dominanti rispetto alle altre specie identificate. Inoltre, la maggior parte delle specie di insetti catturati è risultata la più abbondante nel periodo estivo, con la prima comparsa degli adulti in marzo-aprile, fatta eccezione per la specie E. lineolatus, la cui popolazione era più abbondante nel periodo invernale. La trasmissione propagativa circolativa o transovarica è stata esclusa poiché nessun campione di insetti adulti delle nuove generazioni di tutte e tre le specie è risultato positivo alla presenza di X. fastidiosa. I risultati di questa ricerca portano quindi a raccomandare, come misura di contrasto alla diffusione del batterio, l’uso di mezzi e metodi di lotta contro le forme giovanili del vettore P. spumarius da fine marzo a metà aprile. Rimane da dimostrare la capacità di trasmissione o meno di X. fastidiosa delle specie N. campestris e E. lineolatus. L’analisi diagnostica sugli insetti spia (insetti che acquisiscono il batterio) può risultare strategica nel monitoraggio di X. fastidiosa in aree apparentemente incontaminate. Studi sono stati pertanto condotti in un piccolo focolaio di X. fastidiosa (puntiforme) e nella zona cuscinetto. Gli insetti catturati, da maggio a giugno 2014, sono risultati infetti attraverso PCR in esemplari adulti delle 3 specie su menzionate di Auchenorrinchi, ma non in quelli di altre 3 specie catturate. Gli adulti infetti di queste tre specie sono stati rilevati in tutta la zona cuscinetto in un raggio di un Km dal sito di infezione. gli adulti di queste specie positive a X. fastidiosa hanno confermato il loro ruolo importante per rivelare immediatamente la presenza del patogeno in aree apparentemente indenni, prima della comparsa di sintomi sulle piante. Un altro studio è stato condotto sulle endoglucanasi di X. fastidiosa, enzimi che rompono i legami β-1,4 glicosidici che compongono la matrice esopolisaccaride del biofilm che protegge il batterio. Una volta acquisito, X. fastidiosa si moltiplica e colonizza l’apparato boccale dell’insetto formando il biofilm. Si è ipotizzato che l’endoglucanasi contribuisce a dissolvere il biofilm, interrompendo così la “trasmissione” del batterio nelle piante ed essere utilizzato come misura di controllo biologico. Pertanto è stata studiata l'acquisizione, la conservazione e la trasmissione di un mutante di X. fastidiosa, al fine di esplorare questo effetto dissolutorio del biofilm. Sono stati condotti test di trasmissione in laboratorio e valutato i risultati ottenuti attraverso qPCR e microscopia elettronica a scansione. E’ stato dimostrato che l’endoglucanasi modula l'adesione batterica alla cuticola dell’insetto nel tempo ed influenza di conseguenza il periodo di conservazione della X. fastidiosa.