Studio della risposta a Pseudomonas syringae pv. Actinidiae (PSA) di selezioni di Actinidia deliciosa e di Actinidia chinensis ottenute da miglioramento genetico non convenzionale

Abstract

Per le conoscenze attuali le cultivar di kiwi (Actinidia chinensis ed Actinidia deliciosa) coltivate nel mondo non manifestano resistenza al patogeno batterico Pseudomonas syringae pv. Actinidiae (PSA). Alcune risultano più tolleranti (A. deliciosa, cv. Hayward) mentre altre molto meno (A. chinensis, cv. Zespry Gold). Questa situazione, associata all’alta aggressività del batterio, ha causato da subito forti perdite di produzione con un elevato impatto sulla coltivazione e sul reddito dei produttori. Recentemente i grandi sforzi a livello mondiale nelle attività di miglioramento genetico, stanno producendo alcune varietà con una maggiore tolleranza al patogeno (A. chinensis, cv. G3, Soreli, Dorì), specie nelle varietà a “polpa gialla” da subito risultate più suscettibili. Il presente lavoro, svolto in vivo e in vitro, ha alla base l’approccio genetico di tipo non convenzionale per l’ottenimento di selezioni di cui è stata in seguito valutata la suscettibilità al patogeno tramite diverse tecniche di inoculo artificiale. Per le attività di miglioramento genetico si è deciso di applicare l’Etil-Metano-Sulfonato (EMS), un forte mutagene chimico in grado di reagire con gli acidi nucleici causando mutazioni puntiformi sul DNA per alchilazione dei nucleotidi o per delezione della guanina. Per gli inoculi con il batterio, al fine di valutare la risposta dei nuovi individui, si è utilizzato il ceppo CREA-FRU 8.43 (ad una concentrazione minima di 106 ufc/ml). Il lavoro in vivo è stato preceduto dall’esplorazione genetica del materiale disponibile, sia varietà commerciali che selezioni presenti nei campi sperimentali del CREA-FRU. Le 14 varietà commerciali selezionate sono state innestate su portainnesto infetto con PSA, nessun individuo è risultato sopravvissuto. Altro materiale genetico è stato collezionato in campi coltivati e altamente infetti da PSA. In particolare sono stati raccolti e moltiplicati 2 cloni del maschio Tomuri che manifestavano forte tolleranza rispetto le altre piante dell’appezzamento. Infine si è proceduto a monitorare le selezioni presenti presso il CREA-FRU sopravvissute a seguito dei forti attacchi del patogeno del 2011/2012 individuandone 19 sulle circa 1750 originariamente presenti. Quindi i 2 cloni Tomuri, parte delle 19 selezioni del CREA-FRU, Hayward ed 1 selezione messa a disposizione dall’Università di Udine sono stati impiegati nei programmi di breeding successivi. Nel primo esperimento si è applicato l’EMS per un tempo di 18 ore e in 3 diverse concentrazioni (0,2; 0,3; 0,4%) a circa 11.000 semi ottenuti da libera impollinazione di diverse specie di actinidia: 3600 Hayward, 3600 di RII28 e 3600 di C8 (2 selezioni di A. chinensis del CREA-FRU e dell’Università di Udine rispettivamente). Più del 90% dei semi ha germinato ed a circa 120 giorni le piantine nate sono state infettate con il batterio tramite inoculo diretto nel peduncolo fogliare. Dopo ulteriori 120 giorni le piante sopravvissute sono state nuovamente inoculate tramite infiltrazione (per pressione) nel mesofillo fogliare di una sospensione di PSA in acqua. Nel secondo esperimento l’EMS (1%) è stato applicato (1 o 2 h) direttamente sulle antere di alcune selezioni del CRA-FRU (RII33; RI8; RI14) e di Tomuri. La germinabilità e vitalità del polline estratto dalle antere è stata valutata e ritenuta idonea per l’esecuzione di incroci controllati dai quali sono state ottenuti circa 12.000 semi. Il tasso di germinazione rilevato è stato di circa il 10%. Le piantine ottenute sono state inoculate come in precedenza. Alla fine di tale attività di selezione in vivo sono stati ottenuti alcuni semenzali promettenti che sono stati clonati in vitro, trasferiti in serra e sottoposti a ulteriore valutazione. Il lavoro di selezione in vitro è stato preceduto dall’ottimizzazione dei protocolli di rigenerazione avventizia per la cv. Hayward e per la cultivar di A. chinensis Soreli. È stato valutato l’effetto sulla capacita rigenerativa da foglia della durata del trattamento di buio (7, 14, 21 giorni) e dell’applicazione di diverse citochinine (Benziladenina, Zeatina e Tidiazuron). Definito il miglior protocollo per le 2 cultivar, si è proceduto ad applicare il mutagene ai calli ottenuti dai frammenti fogliari. L’EMS (1%) è stato applicato per 4 diversi tempi (30, 60, 120 e 240 min). Il tempo di applicazione del mutagene ha influenzato l’incidenza delle necrosi dei calli, la loro capacità rigenerativa e, soprattutto, i tempi di formazione e il numero dei germogli avventizi prodotti. Gli espianti raccolti dai calli rigeneranti a seguito di applicazione del mutagene sono stati moltiplicati su terreno di coltura ed in seguito inoculati con PSA. Gli inoculi sono stati eseguiti utilizzando una sospensione di PSA in acqua che nel primo metodo è stata depositata sulla ferita fogliare mentre nel secondo metodo è stata utilizzata per immergervi la parte basale del germoglio. Ad oggi alcuni cloni che hanno mostrato, dopo la prima fase di screening in vitro, una certa tolleranza al batterio sono in fase di moltiplicazione al fine di completare la caratterizzazione di risposta al patogeno sia in vitro che in vivo.

For current knowledge, cultivars of kiwifruit (Actinidia chinensis and Actinidia deliciosa) cultivated in the world do not exhibit resistance to the bacterial pathogen Pseudomonas syringae pv. Actinidiae (PSA). Some are more tolerant (A. deliciosa, cv Hayward) while others are much less (A. chinensis, cv. Zespry Gold). This situation, coupled with the high aggressiveness of the bacterium, has immediately caused severe production losses with a high impact on producers' crop and income. Recently, major worldwide efforts in genetic improvement are producing some varieties with higher pathogen tolerance (A. chinensis, cv G3, Soreli, Dorì), especially in the "yellow flesh" varieties that have since been more susceptible. This work, in vivo and in vitro, has the underlying unconventional genetic approach to obtain selections that were subsequently evaluated for susceptibility to the pathogen through various artificial inoculum techniques. For plant breeding, it was decided to apply Ethyl-Methane-Sulfonate (EMS), a strong chemical mutagen capable of reacting with nucleic acids causing point mutations on DNA for nucleotide alkylation or guanine deletion. For the inoculum with the bacterium, the CREA-FRU 8.43 strain (at a minimum concentration of 106 ufc / ml) was used to evaluate the response of new individuals. In vivo work was preceded by the genetic exploration of available material, both commercial varieties and selections present in experimental fields of CREA-FRU. The 14 selected commercial varieties were grafted onto PSA-infected rootstocks, and none of the individuals survived. Other genetic material was collected in highly cultivated and highly infected PSA fields. In particular, two Tomuri male clones were collected and multiplied, which showed strong tolerance over the other plants of the specimens. Finally, we monitored the selections present at the CREA-FRU survived as a result of the strong attacks of the 2011/2012 pathogen by identifying 19 of the approximately 1750 originally present. The two Tomuri clones, part of the 19 selections of CREA-FRU, Hayward and 1 selection made available by the University of Udine were used in subsequent breeding programs. In the first experiment EMS was applied for 18 hours and at 3 different concentrations (0.2, 0.3, 0.4%) to about 11,000 seeds obtained by free pollination of different Actinidia species: 3600 Hayward , 3600 of RII28 and 3600 of C8 (2 selections of A. chinensis of CREA-FRU and of Udine University respectively). More than 90% of the seeds germinated and about 120 days the seedlings were infected with the bacterium by direct inoculation into the leaf peduncle. After another 120 days, the surviving plants were again inoculated by infiltration (by pressure) into the leaf mesophilic of a PSA suspension in water. In the second experiment EMS (1%) was applied (1 or 2 h) directly on the anthers of some selections of CRA-FRU (RII33; RI8; RI14) and Tomuri. The germination and vitality of pollen extracted from the anthers was evaluated and considered suitable for the execution of controlled crossings from which about 12,000 seeds were obtained. The germination rate observed was about 10%. The seedlings obtained were inoculated as before. At the end of this in vivo selection activity, some promising seedlings were obtained and, afterwards, were cloned in vitro, transferred to greenhouse and subjected to further evaluation. The in vitro selection work was preceded by the optimization of the adventitious regeneration protocols for Hayward and A. chinensis Soreli cultivars. The effect on the regenerative leaf capacity of the duration of the dark phase (7, 14, 21 days) and application of different cytokines (Benzyladenine, Zeatina and Tidiazuron ) were evaluated. For defining the best protocol for the 2 cultivars, the mutagenic agent was applied to the calluses obtained from leaf fragments. The EMS (1%) was applied for 4 different times (30, 60, 120 and 240 min). The time of application of mutagenesis has affected the incidence of callus necrosis, their regenerative capacity and, above all, the formation times and the number of adventitious shoots produced. Explants collected by the regenerating calluses following mutagenesis were multiplied on culture medium and then inoculated with PSA. Inoculations were performed using a PSA suspension in water, which in the first method was deposited on the leaf wound while in the second method it was used to immerse the basal part of the sprout. To date some clones that have shown, after the first in vitro screening phase, some bacterial tolerance are being multiplied in order to complete the characterization of pathogen response both in vitro and in vivo.