Chitosan based nanocomposites for enzyme immobilization: characterization and application study in wine-like medium

Abstract

This PhD thesis research project was aimed to obtain proper biopolymer nanocomposite films as carriers for enzyme immobilization to be applied in winemaking process. In order to achieve this purpose, chitosan was selected as suitable polymeric matrix and nanoclays as inorganic fillers. Films of several compositions were produced by solvent casting technique, adding glycerol as plasticizer. Membrane morphology, microstructure, thermal and mechanical properties were investigated. The enzyme loading capacity of film samples and catalytic properties (in terms of maximum velocity of the enzyme-catalyzed reaction (Vmax) and the Michaelis-Menten constant (KM) were tested after covalent bounding of bromelain on carriers. The proteolytic activity of the vegetable protease was evaluated toward tripeptide chromogenic substrate in wine like medium. In a preliminary step, films of chitosan from two different sources, microbial (Aspergillus niger) and animal (shell fish, characterised by three different molecular weights), were prepared by a solvent casting technique, and then characterised and tested for use as a covalently linked bromelain carrier in wine-like medium. On the basis of these characterisations, it was possible to conclude that films based on low molecular weight chitosan blended with 25 % glycerol should be considered the most suitable for application in wine-making, presenting the best balance between stress strain, flexibility and kinetic properties, even if the highest bromelain immobilization yield (41 %) was observed on Aspergillus niger chitosan blended with 25 % glycerol. Thus, nanocomposites were prepared adding nanoclays to the composition based on low molecular weight chitosan blended with 25 % glycerol. Five different nanoclay kinds were identified and compared: i) high purity unmodified montmorillonite (SMP); ii) high purity organic ammonium derivatives montmotillonite (DK1); iii) high purity organically modified montmorillonite (DK2); iv) selected and activated montmorillonite authorized to come into contact with food (OPT); and v) high purity unmodified sepiolite (PAN). They were employed at different amounts (i.e. 1, 3 and 5 % w/w with respect to the chitosan) and disagglomerated via ultrasonication, leading to enhanced mechanical properties, particularly in the case of films based on SMP and PAN. However, the nanoclay inclusion 2 at low amount (i.e. 1, 3 and 5 % w/w) decreased proteolytic activity of bromelain covalently immobilized onto the carrier. Thus, in order to investigate the influence of the different tested nanoclays on the enzymatic activity, films loaded at high nanoclay contents (i.e. 70, 75 and 80 % w/w) were prepared, using the SMP and OPT kinds, as examples. In these cases, enhanced proteolytic activity of bromelain covalently immobilized was recorded, due to the improved electrostatic interaction between the nanoclays and the enzyme and to the rougher film surface that allowed a better enzyme immobilization.

Questo progetto di dottorato ha riguardato lo sviluppo di carriers enzimatici, biopolimerici nanocompositi, per applicazioni in campo enologico. I film a base chitosano, di diversa origine (microbica e animale) e peso molecolare (basso, medio e alto), sono stati ottenuti mediante solvent casting, variando il contenuto di glicerolo e aggiungendo cinque diverse nanoargille, ulrasonicate e non: i) una montmorillonite non modificata; ii) una montmorillonite non modificata certificata per il contatto con gli alimenti; iii) una montmorillonite derivatizzata con ammonio; iv) una montmorillonite modificata per via organica ed v) una sepiolite non modificata. I film, in seguito a caratterizzazione meccanica, sono stati impiegati per l’immobilizzazione covalente di bromelina e l’attività proteolitica dei biocatalizzatori ottenuti è stata valutata in vino modello su substrato sintetico. Nel corso di questo lavoro sono stati ottenuti, per la prima volta, film a base di chitosano da Aspergillus niger. Tuttavia, dopo un primo screening meccanico essi sono stati scartati per la loro eccessiva rigidezza dovuta ad una maggiore natura cristallina del polimero. Tra le membrane realizzate a partire da chitosano da esoscheletro di crostaceo, invece, quello a basso peso molecole è risultato il migliore. Per quanto riguarda l’aggiunta di glicerolo come plasticizzante si è osservato, come atteso, un effetto sulle caratteristiche meccaniche dei film, sia in termini di riduzione della resistenza che di incremento dell’allungamento alla rottura ed è stato scelto il campione con inclusione al 25 % chitosano/glicerolo p/p. Anche in termini catalitici il biocatalizzatore ottenuto con chitosano di origine animale a basso peso molecolare ha mostrato la maggiore Vmax, che è diminuita con l’aggiunta di glicerolo. Tenendo conto sia dei parametri meccanici che di quelli enzimatici è stato scelto, come miglior compromesso, il film ottenuto con chitosano a basso peso molecolare, addizionato con il 25 % p/p di glicerolo (LMW/GLY 75/25). Su questa base (LMW/GLY 75/25) sono quindi state incluse le nanoargille, sia ultrasonicate che non. La disagglomerazione mediante ultrasonicazione ha conferito le migliori performances meccaniche ai film bionanocompositi sperimentalmente prodotti. 4 L’impiego come filler di bassi contenuti di nanoargille ultrasonicate (1, 3 e 5 % p/p) ha prodotto i migliori risultati in termini di proprietà meccaniche, tuttavia sono peggiorate le performances catalitiche della bromelina immobilizzata, in termini di Vmax e KM. Quindi, al fine di indagare l’influenza delle diverse nanoargille sull’attività enzimatica, sono stati preparati film ad alte concentrazioni di nanoargille (70, 75 e 80 % p/p), usando la montmorillonite non modificata e la montmorillonite non modificata certificata per il contatto con gli alimenti. In questo caso è stato osservato un incremento dell’attività proteolitica della bromelina covalentemente immobilizzata, grazie alla maggiore interazione elettrostatica tra le nanoargille e l’enzima ed alla maggiore ruvidità superficiale del film, che ha condotto ad una migliore immobilizzazione enzimatica.