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Title: Chitosan based nanocomposites for enzyme immobilization: characterization and application study in wine-like medium
Other Titles: Nanocompositi a base di chitosano per immobilizzazione enzimatica: caratterizzazione e studio di applicazione in vino modello
Authors: Zappino, Matteo
Keywords: Chitosan film;Chitosan/clay nanocomposite;Bromelain;Enzyme immobilization;Model wine;Film di chitosano;Nanocompositi chitosano/argilla;Bromelina;Immobilizzazione enzimatica;Vino modello;AGR/15
Issue Date: 4-Jun-2015
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 27. ciclo
Abstract: 
This PhD thesis research project was aimed to obtain proper biopolymer nanocomposite
films as carriers for enzyme immobilization to be applied in winemaking process.
In order to achieve this purpose, chitosan was selected as suitable polymeric matrix and
nanoclays as inorganic fillers. Films of several compositions were produced by solvent
casting technique, adding glycerol as plasticizer. Membrane morphology, microstructure,
thermal and mechanical properties were investigated. The enzyme loading capacity of film
samples and catalytic properties (in terms of maximum velocity of the enzyme-catalyzed
reaction (Vmax) and the Michaelis-Menten constant (KM) were tested after covalent
bounding of bromelain on carriers. The proteolytic activity of the vegetable protease was
evaluated toward tripeptide chromogenic substrate in wine like medium.
In a preliminary step, films of chitosan from two different sources, microbial (Aspergillus
niger) and animal (shell fish, characterised by three different molecular weights), were
prepared by a solvent casting technique, and then characterised and tested for use as a
covalently linked bromelain carrier in wine-like medium.
On the basis of these characterisations, it was possible to conclude that films based on low
molecular weight chitosan blended with 25 % glycerol should be considered the most
suitable for application in wine-making, presenting the best balance between stress strain,
flexibility and kinetic properties, even if the highest bromelain immobilization yield (41
%) was observed on Aspergillus niger chitosan blended with 25 % glycerol.
Thus, nanocomposites were prepared adding nanoclays to the composition based on low
molecular weight chitosan blended with 25 % glycerol. Five different nanoclay kinds were
identified and compared: i) high purity unmodified montmorillonite (SMP); ii) high purity
organic ammonium derivatives montmotillonite (DK1); iii) high purity organically
modified montmorillonite (DK2); iv) selected and activated montmorillonite authorized to
come into contact with food (OPT); and v) high purity unmodified sepiolite (PAN). They
were employed at different amounts (i.e. 1, 3 and 5 % w/w with respect to the chitosan)
and disagglomerated via ultrasonication, leading to enhanced mechanical properties,
particularly in the case of films based on SMP and PAN. However, the nanoclay inclusion
2
at low amount (i.e. 1, 3 and 5 % w/w) decreased proteolytic activity of bromelain
covalently immobilized onto the carrier.
Thus, in order to investigate the influence of the different tested nanoclays on the
enzymatic activity, films loaded at high nanoclay contents (i.e. 70, 75 and 80 % w/w) were
prepared, using the SMP and OPT kinds, as examples. In these cases, enhanced proteolytic
activity of bromelain covalently immobilized was recorded, due to the improved
electrostatic interaction between the nanoclays and the enzyme and to the rougher film
surface that allowed a better enzyme immobilization.

Questo progetto di dottorato ha riguardato lo sviluppo di carriers enzimatici, biopolimerici
nanocompositi, per applicazioni in campo enologico. I film a base chitosano, di diversa
origine (microbica e animale) e peso molecolare (basso, medio e alto), sono stati ottenuti
mediante solvent casting, variando il contenuto di glicerolo e aggiungendo cinque diverse
nanoargille, ulrasonicate e non: i) una montmorillonite non modificata; ii) una
montmorillonite non modificata certificata per il contatto con gli alimenti; iii) una
montmorillonite derivatizzata con ammonio; iv) una montmorillonite modificata per via
organica ed v) una sepiolite non modificata. I film, in seguito a caratterizzazione
meccanica, sono stati impiegati per l’immobilizzazione covalente di bromelina e l’attività
proteolitica dei biocatalizzatori ottenuti è stata valutata in vino modello su substrato
sintetico.
Nel corso di questo lavoro sono stati ottenuti, per la prima volta, film a base di chitosano
da Aspergillus niger. Tuttavia, dopo un primo screening meccanico essi sono stati scartati
per la loro eccessiva rigidezza dovuta ad una maggiore natura cristallina del polimero. Tra
le membrane realizzate a partire da chitosano da esoscheletro di crostaceo, invece, quello a
basso peso molecole è risultato il migliore. Per quanto riguarda l’aggiunta di glicerolo
come plasticizzante si è osservato, come atteso, un effetto sulle caratteristiche meccaniche
dei film, sia in termini di riduzione della resistenza che di incremento dell’allungamento
alla rottura ed è stato scelto il campione con inclusione al 25 % chitosano/glicerolo p/p.
Anche in termini catalitici il biocatalizzatore ottenuto con chitosano di origine animale a
basso peso molecolare ha mostrato la maggiore Vmax, che è diminuita con l’aggiunta di
glicerolo. Tenendo conto sia dei parametri meccanici che di quelli enzimatici è stato scelto,
come miglior compromesso, il film ottenuto con chitosano a basso peso molecolare,
addizionato con il 25 % p/p di glicerolo (LMW/GLY 75/25).
Su questa base (LMW/GLY 75/25) sono quindi state incluse le nanoargille, sia
ultrasonicate che non. La disagglomerazione mediante ultrasonicazione ha conferito le
migliori performances meccaniche ai film bionanocompositi sperimentalmente prodotti.
4
L’impiego come filler di bassi contenuti di nanoargille ultrasonicate (1, 3 e 5 % p/p) ha
prodotto i migliori risultati in termini di proprietà meccaniche, tuttavia sono peggiorate le
performances catalitiche della bromelina immobilizzata, in termini di Vmax e KM.
Quindi, al fine di indagare l’influenza delle diverse nanoargille sull’attività enzimatica,
sono stati preparati film ad alte concentrazioni di nanoargille (70, 75 e 80 % p/p), usando la
montmorillonite non modificata e la montmorillonite non modificata certificata per il
contatto con gli alimenti. In questo caso è stato osservato un incremento dell’attività
proteolitica della bromelina covalentemente immobilizzata, grazie alla maggiore
interazione elettrostatica tra le nanoargille e l’enzima ed alla maggiore ruvidità superficiale
del film, che ha condotto ad una migliore immobilizzazione enzimatica.
Description: 
Dottorato di ricerca in Biotecnologie degli alimenti
URI: http://hdl.handle.net/2067/3071
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