Performances and microbial composition of mesophilic and thermophilic anaerobic sludge digestion processes

Abstract

The anaerobic digestion (AD) of organic wastes as sewage sludge still gathers a great interest due to the global needs for recycling and renewable energy production. The need of solutions for sustainable sludge disposal is increasing and anaerobic sludge treatment can be applied as cost-effective strategy, because it also allow to energy production in the form of biogas. AD of biological solids like sludge requires the hydrolysis of particulate matter to soluble substrates, rate-limiting step of the whole process. A pretreatment, mechanical or thermal, can enhance digestibility of sludge by disintegration, facilitating the release of organic matter in solution. Moreover, the performances of the AD process are primarily linked to the structure of the microbial community present in the system. However, knowledge of the microbial community structure – function relationships is limited. This thesis presents results from microbiological investigations (mainly fluorescence in situ hybridization (FISH) and 16S rRNA gene clonal analysis) of three advanced sludge stabilization systems. The different research activities were conducted in the framework of the EU project “ROUTES” (Novel processing routes for effective sewage sludge management). Three different lab-scale AD processes were operated: 1) a thermophilic anaerobic digestion (TAD) of untreated and thermal pretreated waste activated sludge (WAS), 2) an innovative two stage mesophilic/thermophilic anaerobic digestion of untreated and ultrasound pretreated WAS, both in semi-continuous mode, and 3) batch mesophilic anaerobic digestion of untreated and ultrasound pretreated WAS. Since the dominant bacteria identified in thermophilic reactors by clonal analysis of 16S rDNA sequences belonged the genus Coprothermobacter, and no specific probe for in situ biomonitoring of this genus is available so far, a new oligonucleotide FISH probe was designed, and its application was optimized on thermophilic sludge samples trough the design of specific helper probes. Thermophilic AD (TAD): The structure and dynamics of the microbial communities selected in two semi-continuous anaerobic digesters fed with untreated and thermal pretreated sludge were investigated. The systems operated for 250 days at different organic loading rate. 16S rRNA gene clonal analysis and fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis allowed to identify the majority of bacterial and archaeal populations. Proteolytic Coprothermobacter spp. and hydrogenotrophic Methanothermobacter spp. living in strict syntrophic association were found to dominate in TAD process. The availability of a readily biodegradable substrate due to pretreatment allowed to significant sCOD removals (more than 55%) corresponding to higher biogas production in the reactor fed with thermal pretreated sludge. Microbial population dynamics analyzed by FISH showed that Coprothermobacter and Methanothermobacter immediately established a stable syntrophic association in the reactor fed with pretreated sludge in line with the overall improved TAD performances observed under these conditions. Innovative two-stage AD: The new approach was based on the concept to sub-divide the AD process into three different stages: 1) an ultrasounds pretreatment to improve hydrolysis, 2) a short mesophilic stage to improve volatile fatty acids formation and 3) a final thermophilic stage to convert these intermediates into methane and contemporarily assure the complete hygienization of the digested sludge. The biodiversity of microbial populations was evaluated in both systems by FISH analysis. Shannon–Weaver diversity (H’) and eveness (E) indices were calculated using FISH data. The increase of digestion temperature drastically affected the microbial composition and selected specialized biomass. Species richness was lower under thermophilic conditions compared to the values estimated in mesophilic samples and it was flanked by similar trend of the evenness indicating that thermophilic communities may be therefore more susceptible to sudden changes and less prompt to adapting to operative variations. HRT of the mesophilic stage was a crucial parameter to improve the performance of the following thermophilic stage. Shortening the HRT, a shift from methane to VFA production was observed, in particular by pretreating the sludge with ultrasounds. This lead to a dominance of syntrophic acetate oxidation during thermophilic stage, due to the high concentrations of VFA conveyed from mesophilic reactors. Mesophilic batch AD: Mesophilic batch anaerobic tests were carried out using two different inocula, in order to evaluate the effect of abundance and physiological conditions of inoculum archaeal cells on ultimate methane yields of sludge anaerobic process with untreated and sonicated sludge. Differences in microbial composition of the startup inocula strongly influenced the overall performances. In particular, the reactors with an acclimated archaeal community obtained an higher specific methane production. FISH analysis of inocula showed that the simultaneous presence of acetotrophic Methanosarcina and Methanosaeta in the archaeal biomass, the higher initial archaeal cells relative abundance and their occurrence in the aggregated forms were the main factors positively affecting the conversion of organic matter into methane. This better physiological state of methanogens allowed to appreciate the effect of hydrolysis improvement by ultrasounds pretreatment in terms of biogas daily production. Design of a FISH probe targeting the genus Coprothermobacter: A specific 16S rRNA-targeted oligonucleotide probe for detecting members of Coprothermobacter genus was designed on the basis of the 16S rDNA sequences obtained by a clonal analysis of thermophilic sludge. The newly designed CTH485 probe and helpers probes hCTH429 and hCTH439 were optimized for use in fluorescence in situ hybridization on thermophilic anaerobic sludge samples. In situ probing revealed that thermo-adaptive mechanisms shaping the 16S rRNA could generally affect the in situ identification of thermophilic microrganisms, despite do not adversely affect the analysis. The novel developed FISH probe extends the possibility to study the widespread thermophilic syntrophic interaction of Coprothermobacter spp. with hydrogenotrophic methanogenic archaea, whose establishment is a great benefit for the whole anaerobic system.

La digestione anaerobica di scarti organici, come i fanghi reflui, suscita ancora grande interesse grazie alla necessità comune di produzione di energie rinnovabili e del riciclo di materiali. La necessità di trovare soluzioni per uno smaltimento ecosostenibile dei fanghi di risulta è crescente e il trattamento anaerobico dei fanghi può essere applicato come una strategia conveniente dal punto di vista economico, poichè permette inoltre di recuperare energia sottoforma di biogas. La digestione anaerobica di solidi biologici come il fango richiede l’idrolisi del materiale particolato a substrati solubili, e questo risulta essere la fase limitante dell’intero processo di digestione. Un pretrattamento di tipo meccanico o termico può aiutare dunque a migliorare la digestione dei fanghi, poiché attraverso la disintegrazione delle sue componenti si facilita il rilascio della sostanza organica in soluzione. Inoltre, le prestazioni del processo di digestione sono direttamente correlate alla struttura della comunità microbica presente nel sistema; nonostante ciò, le conoscenze riguardo la relazione tra comunità microbica e la loro funzione all’intero del digestore sono limitate. Questa tesi presenta i risultati delle indagini microbiologiche (principalmente attraverso ibridazione fluorescente in situ (FISH) ed analisi clonale del gene per rRNA 16S) condotte diversi sistemi di digestione anaerobica. Le attività di ricerca sono stae condotte nel contesto del progetto europeo ROUTES (Novel processing routes for effective sewage sludge management). I tre differenti sistemi di digestione anaerobica in scala da laboratorio analizzati sono: 1) una digestione anaerobica in condizioni termofile (TAD) utilizzando come substrato sia fango attivo tal quale che pretrattato con idrolisi termica; 2) un processo innovativo doppio-stadio mesofilo/termofilo utilizzando come substrato sia fango tal quale che fango pretrattato con ultrasuoni; 3) digestione anaerobica batch in condizioni mesofile, utilizzando come substrato sia fango tal quale che fango pretrattato con ultrasuoni. L’analisi clonale ha evidenziato che i batteri dominanti durante le digestioni condotte in termofilo appartenevano al genere Coprothermobacter, per il quale non era disponibile una specifica sonda FISH; una delle attività principali del lavoro di tesi è stata dunque quella di progettare ed applicare una sonda specifica che permettesse di identificare i membri di questo genere. Digestione Anaerobica Termofila: In questo studio è’ stata approfondita la struttura e la dinamica delle popolazioni microbiche coinvolte nel processo di digestione di fango tal quale e pretrattato con idrolisi termica. I due sistemi hanno funzionato per un periodo di 250 giorni con diverso carico organico. L’analisi clonale del gene per rRNA 16S e la FISH hanno permesso di identificare la maggior parte della popolazione microbica. I microrganismi dominanti erano il batterio proteolico Coprothermobacter e il metanogeno idrogenotrofo Methanothermobacter, di cui è stata largamente documentata in letteratura la loro associazione sintrofica. La disponibilità di un substrato prontamente biodegradabile, dovuto al pretrattamento iniziale del fango alimentato al sistema, ha portato a una maggiore produzione di biogas nel reattore alimentato con frango pretrattato. I dati FISH hanno evidenziato l’immediato stabilirsi della sintrofia tra Coprothermobacter e Methanothermobacter in questo reattore, in linea con le migliori prestazioni di quest’ultimo rispetto al reattore alimentato con fango tal quale. Digestione anaerobica doppio stadio: Questo nuovo approccio è basato sul concetto di suddividere il processo di digestione anaerobica in tre differenti stadi: 1) un pretrattamento ad ultrasuoni che idrolizzi il fango alimentato al sistema; 2) uno stadio mesofilo corto per migliorare la produzione di acidi grassi volatili and 3) uno stadio termofilo finale al fine di convertire in metano gli acidi grassi prodotti durante lo stadio mesofilo, e contemporaneamente garantire l’igienizzazione del digestato ad alte temperature. La biodiversità della comunità microbica è stata valutata utilizzando gli indici di Shannon-Weaver (H’) e Pielou Eveness (E) sulla base della quantificazione FISH. L’incremento della temperatura di digestione ha influito drasticamente sulla composizione della comunità microbica a ha selezionato una biomassa altamente specializzata.Entrambi gli indici hanno rivelato una minore biodiversità per il processo termofilo, indicando una maggiore suscettibilità del sistema a variazioni improvvise e meno pronto ad adattarsi a eventuali cambiamenti operativi. Il tempo di ritenzione idraulica (HRT) dello stadio mesofilo si è rivelato un parametro molto importante nel migliorare le prestazioni del successivo stadio termofilo. Accorciando l’HRT, si è infatti osservato uno slittamento dalla produzione di metano alla produzione di acidi grassi volatili, in particolare nel sistema alimentato con fango pretrattato ad ultrasuoni. L’alta concentrazione di acidi grassi volatili nel sistema termofilo, accompagnata all’assenza di metanogeni acetotrofici, ha determinato la domninanza del pathway di ossidazione sintrofica dell’acetato nel reattore termofilo. Digestione Anaerobica batch in condizioni mesofile: In questo studio sono state condotte due test di digestione, utilizzando due differenti inoculi anaerobici, al fine di valutare l’effetto dell’abbondanza relativa e delle condizioni fisiologiche degli archaea metanogeni su due prove parallele alimentate con fango tal quale e pretrattato con ultrasuoni. Le differenze nell’inoculo di partenza hanno fortemente influenzato l’andamento del processo in entrambi i test. Nello specifico, i reattori in cui l’inoculo di partenza era stato acclimatato in condizioni batch, ha ottenuto la più alta resa in metano in termini di conversione della sostanza organica. L’analisi FISH degli inoculi ha mostrato la presenza dei metanogeni acetotrofici Methanosarcina e Methanosaeta; la loro maggiore abbondanza e la loro aggregazione in cluster sono stati i maggiori fattori che hanno influenzato positivamente l’andamento dell’intero processo di digestione. L’aggregazione delle cellule, direttamente correlata a un migliore stato fisiologico dei questi due microrganismi metanogeni, ha consentito di apprezzare l’effetto del pretrattamento ad ultrasuoni sullo stage di idrolisi in termini di produzione giornaliera di biogas. Design di una sonda FISH per il genere Coprothermobacter: Sulla base delle sequeunze del rDNA 16S collezionate durante l’analisi clonale dei sistemi termofili, è stata progettata una nuova sonda FISH per l’identificazione dei membri del genere Coprothermobacter. Assieme alla sonda, denominata CTH485, sono stati progettati anche due oligonucleotidi helper, CTH429 e CTH439, al fine di ottimizare l’ibridazione migliorare la fluorescenza delle cellule nei campioni di fango digerito. L’applicazione della sonda su campione reale ha infatti evidenziato che probabilmente esistono dei meccanismi termo-adattativi, legati sia all’rRNA 16S che alla struttura del ribosoma, che possono influenzare l’identificazione in situ di questi microrganismi, ma non impedirla. La nuova sonda estende la possibilità di studiare questo importante microrganismo nel suo contesto e di approfondire le sue interazioni sintrofiche con gli archaea idrogenotrofi, le quali sono di estrema importanza per l’intero sistema.