New biotechnological approaches for the development of a fluorescence-based multiarray biosensor for environmental agrifood monitoring and for the production of algal biomass

Abstract

Thesis work is composed of two parts both realized for two independent industrial projects. In the first part the green microalga Chlorella minutissima was used to produce biomass at low costs for applications in biofuel production. Biofuel generation requires the production of lipids from biomass at low costs. In order to produce biomass, the green alga Chlorella minutissima was chosen because in literature is reported to produce large amounts of lipids. It is known that several algae of Chlorella genus are able to establish endosymbiosis with other organisms and the most famous example of this association is the endosymbiosis between Chlorella vulgaris and Paramecium Bursaria. During the experiments focused on the selection of the best culture medium deriving from farm and industrial wastes, we isolated two protists which are able to establish endosymbiosis with Chlorella minutissima. The two protists were identified as Tetrahymena pyriformis and Chilomonas paramecium. We found that the presence of these organisms in algal cultures determines an increase of the biomass/lipid production and a longer vitality of the mixed culture compared to culture with algae alone. An international patent was deposited. In order to identify with precision the symbiotic organisms, molecular analyses were attempted. In particular, we used PCR analyses on total DNA extracted from our isolated microorganisms and the same organisms obtained from culture collections, but no results were obtained. The second part of the thesis, divided in two subparts, is focused on the development of a multiarray biosensor based on fluorescence for environmental and agrifood monitoring. Biosensors are defined as devices which use a biological recognition element retained in direct spatial contact with transduction system. In the part IIa of this thesis, we studied symbiosis between Chlorella minutissima and protists in order to use them as biomediators. The symbiosis establishment determines changes in the culture that produces aggregates of different size in relation to the culture age. The algae are surrounded of the thick membrane called PV (perialgal vacuole), being more resistant to environmental stresses. We studied why some algae are able to establish symbiosis and others not. In literature various hypotheses were formulated, but no evident results were obtained. We hypnotized that this phenomenon could be determined by the presence of some particular lipids. We performed lipid analyses on samples of two symbiotic algae (Chlorella minutissima and sorokiniana H1986) and two non symbiontic ones (Chlorella prototecoides and mirabilis) that indicated that there is a great difference in the total lipid content between the two algal classes; however, no differences in the fatty acid content could be related to the different behavior. Single culture of Chlorella minutissima and mixed culture of Chlorella minutissima and protists were tested as biomediators in fluorescence-based biosensor in order to detect photosynthetic herbicides. The experiments have shown that symbiotic culture is able to reveal presence of the analyte diuron at the low concentrations of 10-10M and that the response is higher than that obtained with single Chlorella cultures. In the last part of this work, we worked to develop a multiarray biosensor for milk safety and quality assessment. For the analysis of safety, we have chosen three different analytes: diuron (a photosynthetic herbicide), chlorpyrifos (an organophosphorous pesticide) and catechol (a phenolic compound). As biomediators, we used whole cells of Chlamydomonas, the enzyme acetylcholinesterase from Electrophorus electricus and the enzyme tyrosinase from mushroom, respectively. For milk quality monitoring, we revealed urea, lactose and L-lactic acid, using as biomediators urease from Canavalia ensiformis, β-galactosidase from Aspergillus oryzae and L-lactate dehydrogenase from Lactobacillus leichmannii, respectively. Enzyme fluorescence activity was guaranteed by the use of FITC (Fluorescein 5(6)-isothiocyanate) and 5(6)-Carboxynaphthofluorescein. Measurements were performed in buffer and subsequently in milk. Thanks to the identification of the optimal measurement conditions for each biomediator, it was possible to develop in collaboration with Biosensor s.r.l. a multiarray biosensor with six detection cells that permit simultaneous milk on line analyses directly in cowshed.

Il lavoro di tesi è composto di due parti, realizzate per due diversi progetti di ricerca industriale. Nella prima parte, la microalga verde Chlorella minutissima è stata utilizzata per produrre biomassa a basso costo per la produzione di biofuel. La generazione di biofuel richiede la produzione di lipidi dalla biomassa a basso costo. Per produrre biomassa, è stata scelta l’alga verde Chlorella minutissima in quanto in letteratura è riportato essere produtrice di grandi quantità di lipidi. È’ risaputo che alcune alghe del genere Chlorella possono stabilire endosimbiosi con altri organismi e l’esempio più famoso di questa associazione è l’ensosimbiosi tra Chlorella vulgaris e Paramecium bursaria. Durante gli esperimenti effettuati per la selezione del miglior mezzo di coltura derivante da scarti industriali e agricoli, abbiamo isolato due protisti che sono in grado di stabilire endosimbiosi con Chlorella minutissima. I due organismi sono stati identificati come Tetrahymena pyriformis e Chilomonas paramecium. Abbiamo scoperto che la presenza di questi protisti nelle colture algali determina un aumento della produzione di biomassa/lipidi e una vita più lunga della coltura della coltura simbiotica rispetto alla coltura algale singola. Su questo lavoro è stato depositato un brevetto internazionale. Per identificare con esattezza gli organismi simbionti, sono state effettuate analisi molecolari. In particolare, abbiamo utilizzato analisi PCR sul DNA totale estratto dagli organismi isolati nelle nostre colture e dagli stessi organismi ottenuti da collezioni, ma non sono stati ottenuti risultati. La seconda parte della tesi, composta da due sotto parti, è focalizzata sullo viluppo di un biosensore multiarray a fluorescenza per il monitoraggio ambientale e agroalimentare. I biosensori sono definiti come dispositivi che utilizzano un elemento biologico di riconoscimento a diretto contatto con un sistema di trasduzione. Nella parte IIa di questa tesi, abbiamo studiato la simbiosi tra Chlorella minutissima e i protisti per valutare se siano utilizzabili come biomediatori. L’instaurazione della simbiosi determina cambiamenti nella coltura che produce aggregati di diverse dimensioni in base all’età della coltura. Le alghe sono racchiuse da una spessa membrana chiamata PV (vacuolo perialgale) che aumenta la resistenza delle alghe agli stress ambientali. Abbiamo studiato il motivo per cui alcune alghe sono in grado di instaurare simbiosi ed altre no. In letteratura sono presenti varie ipotesi che non sono state totalmente confutate. Abbiamo ipotizzato che questo fenomeno possa essere determinato dalla presenza di alcuni particolari lipidi. abbiamo effettuato analisi dei lipidi su campioni di due alghe simbiotiche (Chlorella minutissima e sorokiniana H1986) e due alghe non simbiotiche (Chlorella prototecoides e mirabilis) che hanno dimostrato che c’è una differenza rilevante del contenuto lipidico tra la prima e la seconda classe di alghe, ma non ci sono differenze nel contenuti di acidi grassi che potrebbero essere correlati al diverso comportamento. La coltura singola di Chlorella minutissima e la coltura in simbiosi con I protisti sono state testate come biomediatori in un biosensore ottico basato sulla fluorescenza per rilevare gli erbicidi fotosintetici. Gli esperimenti hanno dimostrato che la coltura simbiotica è capace di rilevare la presenza dell’analita diuron a concentrazioni basse dell’ordine di 10-10M e che la risposta è più alta rispetto a quella ottenuta per la coltura singola. Nell’ultima parte del lavoro, abbiamo lavorato per sviluppare un biosensore multiarray per valutare la sicurezza e la qualità del latte. Per le analisi sulla sicurezza abbiamo scelto tre analiti: diuron (erbicida fotosintetico), il clorpirifos (pesticida organofosforico) e il catecolo (un composto fenolico). Come biomediatori abbiamo utilizzato cellule intere di Chlamydomonas reinhardtii, l’enzima acetilcolinesterasi da Electrophorus electricus e l’enzima tirosinasi di fungo, rispettivamente. Per il monitoraggio della qualità sono stati rilevati l’urea, il lattosio e D-acido lattico utilizzando gli enzimi ureasi da Canavalia ensiformis, la β-galattosidasi di Aspergillus oryzae e la D-lattato dedrogenasi da Lactobacillus lehicmannii. La fluorescenza è gatantita dall’utilizzo della FITC (Fluorescein 5(6)-isothiocyanate) e della 5(6)-Carboxynaphthofluorescein. Le misure sono state effettuate in buffer e successivamente in latte. Grazie all’identificazione delle condizioni ottimali di misura per ogni biomediatore, è stato possibile sviluppare, in collaborazione con Biosensor s.r.l. un biosensore multiarray con sei celle di rilevamento che permettono analisi simultanee del latte, direttamente in stalla.