Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/3032
Title: Nanoscopic and spectroscopic methods to investigate biomolecular recognitions in cancer research
Other Titles: Metodi nanoscopici e spettroscopici per investigare riconoscimenti biomolecolari nella ricerca sul cancro
Authors: Santini, Simona
Keywords: Cancer;Nanotechnology;Atomic force spectroscopy;Plasmon resonance;Cancro;Nanotecnologie;Spettroscopia a forza atomica;Risonanza plasmonica;FIS/07
Issue Date: 5-May-2016
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 28. ciclo
Abstract: 
Nanoscopic and Spectroscopic techniques are used for the molecular and kinetic characterization of biomolecular interactions of pharmaceutical interest, involving the oncosuppressor p53 both in its wild type and mutated form, proteins belonging to the p53 family, and peptides or proteins showing anticancer activities somehow connected with p53 pathway. Atomic Force Spectroscopy (AFS) and Surface Plasmon Resonance (SPR), have been used, supported by computational approaches and fluorescence spectroscopy.
Great attention has been devoted to get insight into the mechanism of action of the Azurin derived peptide p28 at the single molecule level by AFS and by molecular dynamic simulation. The obtained data, together with common biochemical approaches, showed that p28 binds to the p53 Dna-binding domain (DBD) at level of its L1 loop (aa 112–124) and additional motifs within the binding regions of ubiquitin ligase COP1. Subsequently inhibition of COP1-mediated p53 proteasomal degradation results in p53 stabilization and consequent p53-mediated up-regulation of downstream molecules p21 and p27 both in p53wt and, at least, some p53mut cancer cells, thus leading to the inhibition of cell cycle at G2–M phase.
The interaction of p28 with non physiological DBD mutants leading point mutations in DBD loops involved in the interaction with p28 has been also investigated by AFS to know how the polarity of the p28/DBD interface can affect p28 binding capability. Moreover, being p53 mutated in more than 50% of human cancers, AFS has also been used even to study the p28 binding capability to physiological DBD mutants K164E, double mutant P223L,V274F and the DBD R273H. Obtained data, joint with results from computational study and Raman spectroscopy, suggested that mutations induced reduction in sheets content of specific DBD motif, is connected with a reduction of p28 binding affinity.
In the context of the study of biomolecular recognitions of pharmaceutical interest and search for efficient anticancer drugs, the interaction of both wild type p53 and mutant p53R175H with p73 have been investigated by AFS and SPR. Indeed, such an interaction makes cancer cells more aggressive and chemoresistant due to the abrogation of p73 antitumour function and the search for drugs able to restore the p73 function inhibiting its interaction with the p53 mutant, deserve a fairly good interest. The two techniques revealed that a stable complex is formed between mutant p53R175H and p73; the complex being characterized by a high interaction force and a dissociation equilibrium constant in the order of 10−7 M, as expected for specific interactions.
Finally, the interaction between the blue-copper containing protein Azurin, and its partner Cytochrome C 551 has been studied by SPR and fluorescence spectroscopy. Indeed the protein has attracted growing interest for its prominent anticancer role consequent to its interaction with the tumor suppressor p53 and perhaps involving oxygen reactive species generation in connection with its electron transfer capability. The study, pointing out the occurrence of an encounter complex between Azurin and Cytochrome C 551 evolving toward the formation of a more stable complex characterized by an equilibrium dissociation constant KD typical of transient interactions.

Tecniche nanoscopiche e spettroscopiche sono usate per la caratterizzazione molecolare e cinetica di interazioni biomolecolari di interesse farmacologico coinvolgenti l'oncosoppressore p53 sia nella sua forma wild type che mutata, proteine appartenenti alla famiglia del p53 e proteine o peptidi mostranti attività anticancro in qualche modo connessa con il pathway del p5. La spettroscopia di forza atomica (AFS) e la risonanza plasmonica di superficie (SPR) sono state usate supportate da approcci computazionali e spettroscopia di fluorescenza.
Grande attenzione è stata rivolta alla conoscenza della modalità di azione del frammento peptidico derivante dall'Azzurrina, p28, a livello di singola molecola attraverso AFS e tramite simulazioni di dinamica molecolare. I dati ottenuti, insieme a comuni approcci biochimici, hanno mostrato che il p28 lega il Dna-binding Domain (DBD) del p53 a livello del suo loop L1 (aa 112–124) e motivi addizionali all'interno della regione di binding dell'ubiquitina ligasi COP1. La successiva inibizione della degradazione proteasomica del p53 mediata da COP1risulta nella stabilizzazione del p53 e successiva up-regolazione delle molecole p21 e p27 sia in cellule cancerogene con p53 wild type che alcune forme mutate del p53, portando così alla inibizione della progressione cellulare nella fase G2-M.
L'interazione del p28 con mutanti non fisiologici del DBD portanti mutazioni puntuali in loop del DBD coinvolti nell'interazione con il p28 è stata anche studiata con AFS al fine di sapere come la polarità dell'iterfaccia DBD/p28 possa influire sulla capacità dei binding del p28. Inoltre, essendo il p53 mutato in più del 50 % dei tumori, l'AFS è stata anche usata per studiare la capacità del p28 di interagire con i mutanti fisiologici del DBD K164E, il doppio mutante P223L,V274F ed R273H. I dati ottenuti , uniti a risultata ottenuti da studi computazionali e spettroscopia Raman, hanno suggerito che una riduzione del contenuto in foglietti beta in motivi specifici del DBD, è connessa con una riduzione dell'affinità del p28.
Nel contesto dello studio di riconoscimenti biomolecolari di interesse farmacologico e ricerca di efficaci farmaci anticancro, l'interazione del p53 wild type e del mutante p53R175H con il p73 è stata studiata con AFS ed SPR. Infatti tale interazione rende le cellule cancerogene più aggressive e chemioresistenti a causa dell'abrogazione dell'attività antitumorale di p73 e la ricerca di farmaci in grado di ripristinare la funzione del p73 inibendo la sua interazione con il p53 mutato, riveste un grande interesse. Le due tecniche hanno rivelato che un complesso stabile si forma tra il mutante p53R175H ed il p73; il complesso è caratterizzato da un'alta forza di interazione e costante di dissociazione all'equilibrio nell'ordine di 10-7 M, come atteso per le interazioni specifiche.
Infine, l'interazione tra la proteina blu rame, azzurrina ed il suo partner fisiologico, il Citocromo C551, è stata studiata tramite SPR e spettroscopia di fluorescenza. Infatti, la proteina ha attratto un interesse crescente per la sua prominente attività anticancro conseguente alla sua interazione con l'oncosoppressore p53 e, forse, coinvolgente la generazione di specie reattive dell'ossigeno in connessione con la sua capacità di trasferimento elettronico. Lo studio ha evidenziato la formazione di un "encounter complex" tra l'Azzurrina e il Citocromo C551 che evolve verso la formazione di un complesso più stabile caratterizzato da una costante di dissociazione all'equilibrio tipica dei complessi transienti.
Description: 
Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare
URI: http://hdl.handle.net/2067/3032
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