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Title: Role of Rab7a and RILP in cell migration
Other Titles: Ruolo di Rab7a e RILP nella migrazione cellulare
Authors: Margiotta, Azzurra
Keywords: Migration;Rab7a;RILP;Vimentin;Rac1;CMT2B;Migrazione;Vimentina;BIO/13
Issue Date: 5-May-2016
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 27. ciclo;
Rab7a is a small GTPase of the Rab family that regulates late stages of endocytosis. RILP is an important downstream effector of Rab7a, which can be recruited to membrane from cytosol by this GTPase. Rab7a and RILP control together several aspects of vesicular trafficking. This PhD work focuses on the role of Rab7a and RILP in cell migration, which is a cellular process characterized by cell polarization, protrusion of the cell membrane, formation of new adhesions, contraction and retraction of the cell body.
First of all, we demonstrated in wound healing assay that Rab7a modulates cell motility affecting cell velocity and directness. Moreover, Rab7a alters the formation of filopodia by mislocalizing myosin X, an actin motor known to promote the formation of these protrusions. Furthermore, we investigated the role of Rab7a in cell adhesion. We evaluated the ability of control and Rab7a-depleted cells to spread out on fibronectin-coated coverslips and we found that Rab7a depleted-cells showed a lower ability to spread while re-expression of active Rab7a recovered partially the function. Interestingly, activation, localization and intracellular trafficking of β1-integrin, a component of cell-matrix adhesions, were impaired after Rab7a silencing. Furthermore, as Rab7a interacts with Rac1 and vimentin, important factors for cell motility, we investigated the role of Rab7a on the regulation of these proteins. Interestingly, we found that Rab7a silencing impairs Rac1 activation state but not its abundance. In addition, Rab7a regulates vimentin filaments reorientation during migration. In fact, Rab7a depletion reduced the percentage of migrating cells with vimentin filaments facing the wound. We made some Rab7a mutants to investigate deeply the role of Rab7a in cell migration but the preliminary data collected did not show any difference in behavior of these proteins compared to wild type Rab7a. Similarly, Rab7a mutants which are responsible of the onset of Charcot-Marie-Tooth type 2B neuropathy did not act differently from the wild type protein in the performed experiments.
In light of the above, we demonstrated that Rab7a is necessary for proper cell migration, being able to modulate several aspects of this process and by regulating several key proteins.
Then, we characterized the role of RILP in cell migration by evaluating its role on cell motility, microtubule cytoskeleton, cell polarization and adhesion. We demonstrated that RILP controls cell velocity and cell adhesion, but not Golgi apparatus reorientation and microtubules reorganization.
The discovery of the involvement of Rab7a and RILP in cell migration could be of importance both in physiological and pathological situations.

Rab7a è una piccola GTPasi della famiglia delle proteine Rab e regola gli stadi tardivi dell'endocitosi. RILP è un importante effettore di Rab7a che può essere reclutato dal citosol sulla membrana da questa GTPasi. Rab7a e RILP controllano insieme diversi aspetti del traffico vescicolare. In questo lavoro di dottorato si è studiato il ruolo di Rab7a e RILP nella migrazione cellulare, che è un processo importante in tutti gli organismi ed è caratterizzato dalla polarizzazione cellulare, protrusione della membrana plasmatica, formazione di nuove adesioni, contrazione e retrazione del corpo cellulare.
Innanzitutto, si è dimostrato in esperimenti di wound healing che Rab7a modula la motilità cellulare influenzando la velocità e la direzionalità delle cellule. Inoltre, Rab7a altera la formazione dei filopodi regolando la localizzazione di miosina X, che è una proteina motore responsabile della formazione di queste protrusioni. Successivamente, si è studiato il ruolo di Rab7a nell'adesione cellulare con la fibronectina, una componente della matrice extracellulare. In particolare, si è valutata l'abilità di cellule controllo e silenziate per Rab7a di aderire su vetrini ricoperti da fibronectina. Si è dimostrato che dopo il silenziamento di Rab7a le cellule presentavano una minor abilità nell'aderire al substrato. Tuttavia, la riespressione della proteina Rab7a attiva ha determinato un recupero parziale della funzionalità. Si è riscontrato, inoltre, un'alterazione nell'attivazione, localizzazione e traffico intracellulare dell'integrina β1, una componente delle adesioni cellula-matrice extracellulare, dopo la deplezione di Rab7a. Questa GTPasi interagisce con Rac1 e vimentina, che sono due proteine importanti per la migrazione cellulare. Pertanto, si è studiato il ruolo di Rab7a nella regolazione di queste proteine. Innanzitutto, si è visto che il silenziamento di Rab7a altera lo stato di attivazione di Rac1 ma non la sua abbondanza proteica. Inoltre, Rab7a regola la riorientazione dei filamenti di vimentina durante la migrazione. Infatti, la deplezione di Rab7a ha ridotto la percentuale delle cellule in migrazione che presentavano i filamenti di vimentina orientati nella direzione di migrazione. Successivamente, si sono creati dei mutanti della proteina Rab7a in modo da valutare meglio il ruolo di Rab7a nella migrazione ma i dati preliminari ottenuti non hanno evidenziato alcuna differenza di comportamento tra le proteine mutate e quella wild type. Similiarmente, anche i mutanti di Rab7a che sono responsabili dell'insorgenza della neuropatia di Charcot-Marie-Tooth di tipo 2B non hanno mostrato differenze con la proteina wild type negli esperimenti eseguiti.
Alla luce di tutto ciò, si è dimostrato che Rab7a è necessaria per la migrazione cellulare ed è capace di modulare diversi aspetti e proteine chiave di questo processo.
Successivamente si è analizzato la funzione di RILP nella migrazione cellulare valutando il suo ruolo nella motilità, nella regolazione dei microtubuli, nella polarizzazione e nell'adesione cellulare. Si è, quindi, dimostrato che RILP controlla la velocità e l'adesione cellulare ma non la riorientazione dell'apparato di Golgi e la riorganizzazione dei microtubuli.
La scoperta del coinvolgimento di Rab7a e RILP nella migrazione cellulare potrebbe essere rilevante sia in condizioni fisiologiche che patologiche.
Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare
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