NF-Y and lamin A in cell proliferation and cancer

Abstract

Nuclear transcription factor (NF-Y) is a sequence-specific transcription factor that binds DNA on a sequence spanning the CCAAT a common element present on several gene promoters. It has long been considered an activator of genes involved in growth promotion including cell cycle regulatory genes. NF-Y is composed of three subunits (-YA –YB –YC) all required for the DNA binding and transactivation activity. NF-YA is the regulatory subunit of the NF-Y protein. Numerous findings highlight that NF-Y is involved in cancer. In manuscript I, to get clues on NF-Y function(s) in cancer cells, we performed a mass spectrometry screening of a pool of proteins that co-precipitate with the NF-YA subunit. By this screening we identified lamin A as a novel putative NF-Y interactor. This result was validated by co-IP experiments using different cell lines. Confocal analysis confirmed this interaction in different phases of mitosis. In order to investigate the possible involvement of lamin A/NF-Y complex in gene regulation, we generated the chromatin fractions. Co-IP experiments confirmed the occurrence of lamin A /NF-Y complex in the chromatin. We further isolated euchromatin from proliferating cells in order to evaluate the possible involvement of lamin A in actively transcribed genes involved in cell cycle progression where NF-Y plays a key role as transcription factor. Our data demonstrated that NF-Y and lamin A co-localize in transcriptionally active region. We performed ChIP experiments to explore the possible recruitment of lamin A on promoters of NF-Y target genes demonstrating that lamin A physically interacts with several promoter regions carrying CCAATboxes, such as CCNB2, DHFR, CCNA2, CDK1, CCNB1, CDC25C, TOPO2a and PCNA. Gain and loss of function experiments revealed that lamin A counteracts NF-Y transcriptional activity impacting on cell cycle progression. We performed luciferase assays using the CCNB2 promoter driven luciferase reporter construct as a sensor of NF-Y activity in cellular and mouse models. These experiments revealed that lamin A counteracts NF-Y activity on CCNB2 promoter. Moreover, data obtained from experiments performed under serum deprivation conditions emphasized the importance of lamin A activity in cell proliferation in the tumour microenviroment characterized by low nutrient supply. In manuscript II, we analysed the possible involvement of NF-Y and lamin A in stratifying endometrial cancer (EC). EC is a major cause of mortality for patients worldwide. EC is classified as type I or type II based on histologic properties. Type I, also called the endometrioid type (EEC) because of its histologic similarity to the endometrium, accounts approximately 70–80% of sporadic EC. Most type I tumours occur in the setting of unopposed estrogen stimulation, leading to endometrial hyperplasia. According to FIGO definition, Unlike type I tumors, type II lesions are not related to estrogen exposure or endometrial hyperplasia and include high risk malignancies, as poorly differentiated high-grade EEC (G3), and non endometrioid endometrial carcinomas (NEM) such as serous papillary and clear cell carcinomas. In general, patients with EC have a good prognosis since early diagnosis is frequent and the disease has usually not spread beyond the uterus. However, the prognosis for recurrent or metastatic EC remains poor. Although most cases of low grade ECs do not behave aggressively, in rare instances, even low-grade, well-differentiated ECs can progress in a highly aggressive manner. In this study, we analysed several EC tissues to find novel clinical and biological features to help the diagnosis and consequently the treatment of early EEC (G1). A retrospective cohort of several formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) specimens from patients with EC were analysed. Total RNA and proteins were extracted and analyzed, respectively, by quantitative PCR and western blotting. Our correlation studies identify NF-YAs, a splicing isoform of NF-YA, , and lamin A as two novel potential biomarkers in ECs. It has been recently demonstrated that NF-YAs belongs to the embryonic stem cell transcription factor circuitry. Lamin A has been shown to be involved in cancer development and tumor aggressiveness. We observed that NF-YAs is exclusively expressed in EC tissues, while lamin A is strongly downmodulated in EC compared with benign tissues and its loss of expression correlates with higher histologic grade and aggressiveness. Results obtained in low grade EEC (G1) tissues demonstrated that NF-YAs expression is heterogeneous, with 55% of samples expressing the short isoform compared to 100% in G2 and G3 EEC and NEM. Interestingly, the presence of NF-YAs was related with lower lamin A protein and mRNA levels. It is worth to note that the presence on NF-YAs and loss of lamin A expression was consistently associated with lower estrogen receptor (ERs) expression and related with miR-200 family upregulation and ZEBs decreased expression, indicators of EC aggressiveness, thus supporting the potential role on NF-YAs and lamin A as novel prognostic correlation biomarkers with a potential for a more systematic integration in clinical practice for individualized therapy in EC, in particular in low grade malignancy. Our studies help to promote our understanding of the mechanisms of NF-Y activity providing a molecular evidence for the direct transcriptional modulation of cell cycle related genes by lamin A/NF-Y nuclear protein complex. Moreover, they open up a possibility to use lamin A and NF-YAs expression, in combination with ERs status, in the diagnosis and treatment of early EC.

NF-Y è un fattore di trascrizione che lega il DNA in una sequenza specifica, la CCAAT box, presente in diversi promotori. E’ un attivatore dei geni coinvolti nella promozione della crescita e proliferazione cellulare, compresi i geni regolatori del ciclo cellulare. NF-Y è composto da tre subunità (-YA -YB -YC) tutti essenziali per il legame al DNA e l'attività di transattivazione. NFYA è la subunità regolatrice del complesso NF-Y. Numerosi risultati evidenziano che NF-Y è coinvolto nel cancro. Nel primo manoscritto, per meglio caratterizzare il ruolo di NF-Y nelle cellule tumorali, abbiamo effettuato uno screening attraverso spettrometria di massa di un pool di proteine che sono in grado di associarsi e co-precipitano con la subunità NF-YA. Grazie a questo screening abbiamo identificato la lamina A come un nuovo putativo interattore proteico di NF-Y. Questo risultato è stato convalidato da esperimenti di co-immunoprecipitazione (co-IP) utilizzando diverse linee cellulari. L’analisi tramite microscopia confocale ha confermato questa interazione in diverse fasi della mitosi. Al fine di indagare il possibile coinvolgimento del complesso proteico lamina A/NF-Y nella regolazione genica, abbiamo isolato frazioni cromatiniche da diverse linee cellulari. Esperimenti di co-IP utilizzando tali frazioni hanno ulteriormente confermato la presenza del complesso lamina A/NF-Y nella cromatina. Abbiamo ulteriormente isolato la frazione eucromatinica da cellule proliferanti al fine di valutare il possibile coinvolgimento di lamina A nei geni attivamente trascritti coinvolti nella progressione del ciclo cellulare in cui NF-Y gioca un ruolo chiave come fattore di trascrizione. I nostri dati hanno dimostrato che NF-Y e lamina A colocalizzano nella regione trascrizionalmente attiva. Abbiamo condotto esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per esplorare l'eventuale arricchimento della lamina A su promotori dei geni regolati da NF-Y e abbiamo dimostrato che la lamina A interagisce con promotori di vari geni,tra cui CCNB2, DHFR, CCNA2, CDK1, CCNB1, CDC25C, TOPO2A e PCNA, attraverso le sequenze CCAAT. Esperimenti funzionali hanno rivelato che la lamina A modula negativamente l'attività trascrizionale di NF-Y e ha un ruolo sulla progressione del ciclo cellulare. Abbiamo eseguito saggi della luciferasi utilizzando il promotore della ciclina B2 (CCNB2) come sensore dell’attività trascrizionale di NF-Y sia in modelli cellulari che in modelli murini. Questi esperimenti hanno confermato l’attività inibitoria della lamina A su NF-Y. I dati ottenuti da esperimenti condotti in condizioni di deprivazione di siero o stress ossidativo hanno sottolineato l'importanza della lamina A e del complesso lamina A/NF-Y nella proliferazione cellulare nel microambiente tumorale caratterizzato da bassa apporto di sostanze nutritive e eccessiva produzione di radicali dell’ossigeno. Nel secondo manoscritto, abbiamo analizzato il possibile ruolo di biomarcatori di NF-Y e lamina A nel cancro dell'endometrio. Il cancro dell’endometrio è una delle principali cause di mortalità per i pazienti in tutto il mondo ed è classificato, in base alle caratteristiche istologiche, in due tipi, il tipo I e il tipo. Il tumore dell’endometrio di tipo I, chiamato anche il tipo endometrioide (CEE) per la sua somiglianza istologica con il normale endometrio, rappresenta circa il 70-80% dei tumori endometriali sporadici. La maggior parte dei tumori di tipo I si verifica nel contesto di una sbilanciata ed eccessiva stimolazione da parte degli ormoni estrogeni e conseguente iperplasia endometriale. Secondo la definizione FIGO, i tumori dell’endometrio di tipo I comprendono carcinomi endometrioidi e le neoplasie di grado 1 e 2. A differenza dei tumori dell’endometrio di tipo I, le lesioni di tipo II non sono correlate da un eccesso di estrogeni o iperplasia endometriale e comprendono tumori maligni ad alto rischio, come gli adenocarcinomi endometrioidi di alto grado (G3), e quelli non endometrioidi (NEM), quali carcinomi papillari sierosi e carcinomi a cellule chiare. In generale, i pazienti affetti da tumore dell’endometrio hanno una buona prognosi in quanto la diagnosi precoce è frequente e il tumore è generalmente circoscritto nell'utero. Tuttavia, la prognosi in caso di recidiva o metastasi a distanza rimane infausta. Sebbene la maggior parte dei casi di basso grado non si comportino in modo aggressivo, in rari casi, anche i tumori dell’endometrio di basso grado e ben differenziato possono progredire in modo molto aggressivo. In questo studio, abbiamo analizzato diversi tessuti paraffinati di tumore dell’endometrio allo scopo di identificare nuovi markers per aiutare la diagnosi e di conseguenza il trattamento dei tumori dell’endometrio di grado 1. Nello studio abbiamo condotto una analisi retrospettiva di diversi tessuti inclusi in paraffina (FFPE) da pazienti con tumore endometriale. L’RNA e le proteine estratti sono stati analizzati rispettivamente mediante PCR quantitativa e western blotting. I nostri studi di correlazione ci hanno permesso di identificare NF-YAs, una isoforma di splicing di NF-YA, e la lamina A come due nuovi potenziali biomarcatori nel tumore dell’endometrio. E 'stato recentemente dimostrato che NF-YAs è coinvolto nei meccanismi trascrizionali che caratterizzano le in cellule staminali embrionali. Vari lavori hanno dimostrato che la lamina A ha un importante ruolo nello sviluppo e nell’aggressività di vari tipi di tumore. Nel nostro studio, abbiamo osservato che NFYAs è espressa esclusivamente in tessuti tumorali, mentre la lamina A è fortemente down-modulata nei tessuti tumorali rispetto ai tessuti benigni e la sua perdita di espressione correla con una maggiore grado istologico e aggressività. I risultati ottenuti dai tessuti di adenocarcinoma endometriode di grado 1 hanno dimostrato che l'espressione di NF-YAs è eterogenea, con il 55% dei campioni esprimenti questa isoforma rispetto ai campioni di grado 2 e 3 e non endometrioidi in cui NF-YAs è sempre espressa. E’ importante sottolineare che la presenza di NF-YAs correla con livelli inferiori di lamina A, sia proteici che di mRNA. Inoltre, la presenza di NF-YAs e la perdita di espressione di lamina A sono associate in maniera consistente a un minori livelli di recettori degli estrogeni (ER) e ad un aumento di espressione della famiglia di miR-200 e corrispettiva diminuzione dei livelli di ZEBs , indicatori di aggressività del tumore dell’endometrio, confermando in tal modo il potenziale ruolo di NF-Yas e lamina A come nuovi biomarcatori prognostici con un potenziale di utilità clinica per la terapia individualizzata del cancro dell’endometrio, in particolare quelli di basso grado. I nostri studi contribuiscono a caratterizzare meglio e approfondire i meccanismi molecolari in cui NF-Y è coinvolto e forniscono una prova molecolare del ruolo del complesso proteico costituito da lamina A e NF-Y nella modulazione trascrizionale dei geni del ciclo cellulare. Inoltre, aprono la possibilità di utilizzare l’espressione di lamina A e di NF-YAs, in combinazione con lo stato dei recettori degli estrogeni, nella diagnosi precoce del cancro dell’endometrio di basso grado.