Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/3026
Title: Caratterizzazione dei meccanismi di risposta della vite ad infezioni di peronospora ed oidio mediante approcci di microdissezione laser e silenziamento genico
Other Titles: Characterization of the mechanisms of the grapevine response to downy and powdery mildew through laser microdissection and gene silencing
Authors: Lenzi, Luisa
Keywords: Espressione genica;Geni MLO;Interazione pianta-patogeno;Microdissezione laser;Oidio;Peronospora;RNA interference;Stomi;Vitis vinifera;Downy mildew;Gene expression;Laser microdissection;MOLO genes;Plant-pathogen interaction;Powdery mildew;RNA interference;Stomata;BIO/10
Issue Date: 5-May-2016
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 28. ciclo
Abstract: 
La vite (Vitis vinifera) è una delle più importanti colture a livello mondiale, soprattutto in termini economici. La maggior parte delle varietà usate per la produzione di uva da tavola e da vino sono però suscettibili a numerose malattie, tra le quali la peronospora (causata da Plasmopara viticola) ed l’oidio (causato da Erysiphe necator). Queste malattie sono controllate dall’uso frequente di fungicidi chimici che, oltre ad avere un elevato costo economico per il produttore, hanno effetti nocivi sull’uomo e sull’ambiente e possono causare l’insorgenza di resistenza del patogeno. Per questo motivo vi è un enorme interesse nello sviluppo di alternative eco-compatibili per il controllo di queste due malattie. Ad esempio, l'ottenimento di varietà di vite resistenti ai patogeni rappresenta un'opzione promettente per limitare l'applicazione dei pesticidi chimici in viticoltura. La comprensione approfondita dei meccanismi di difesa della vite a peronospora ed oidio e l'identificazione dei geni chiave della resistenza sono quindi fondamentali per aiutare i programmi di miglioramento genetico finalizzati all’ottenimento di varietà resistenti. Oltre ai geni di resistenza, i geni di suscettibilità sono regolatori chiave dei processi di difesa nelle piante, come i geni Mildew Locus O (MLO) noti per essere responsabili della suscettibilità all’oidio in piante erbacee. Le analisi di espressione genica sono state ampiamente impiegate per comprendere i processi di regolazione dell'interazione della vite con la peronospora e l'oidio e per individuare i geni marcatori della resistenza, ma tutti gli studi condotti finora hanno preso in considerazione la foglia intera. Tuttavia, solo poche cellule sono realmente in contatto con il patogeno ai primi stadi di infezione e i cambiamenti trascrizionali altamente localizzati nelle cellule infette possono essere mascherati dalle restanti cellule non infette nelle analisi di organi interi.
L'obiettivo finale di questo progetto di dottorato era quello di identificare i geni chiave ed i processi cellulari coinvolti nei meccanismi di difesa e di suscettibilità della vite contro la peronospora e l’oidio, per in seguito sviluppare metodologie innovative per il controllo di queste malattie, come varietà resistenti ed induttori di resistenza efficaci. Gli obiettivi specifici sono stati: i) la caratterizzazione della risposta della vite nei siti di infezione della peronospora per individuare le regolazioni trascrizionali sito-specifiche attivate negli stomi infetti, nelle regioni circostanti e nella parte distale non infetta dal patogeno; ii) il silenziamento di quattro geni MLO della vite (MLO-6, MLO-7, MLO-11 e MLO-13), attraverso la metodologia denominata RNA interference, per identificare i geni chiave responsabili della suscettibilità all’oidio.
Per la caratterizzazione delle regolazioni trascrizionali sito-specifiche, è stato ottimizzato il protocollo di microdissezione laser per l’isolamento degli stomi e delle regioni circostanti agli stomi da foglie di vite cresciute in vitro ed è stata analizzata l’espressione di dieci geni nelle fasi iniziali dell'infezione di P. viticola. Il livello di espressione di sette geni di risposta a P. viticola è risultato maggiore nelle microdissezioni rispetto alla foglia intera, indicando una regolazione trascrizionale sito-specifica della risposta della vite alla peronospora. La modulazione dei geni era localizzata negli stomi e nelle regioni circostanti suggerendo l’attivazione di segnali cellulari con un’azione a breve distanza nel tessuto infetto. L’elevata sensibilità della microdissezione laser ha inoltre permesso di identificare la modulazione di tre geni che era completamente mascherata nell’analisi della foglia intera.
Per la caratterizzazione dei geni di suscettibilità, tre linee silenziate nell’espressione dei geni MLO hanno mostrato una maggiore resistenza ad oidio. L’analisi dell’espressione genica nelle linee resistenti e suscettibili ha dimostrato il ruolo chiave del gene MLO-7 nei processi responsabili della suscettibilità all’oidio, con un
contributo additivo dei geni MLO-6 e MLO-11. Il livello di espressione di tredici geni di difesa della vite era inferiore nella linea resistente rispetto alla linea controllo, indicando che la ridotta infezione di E. necator nella linea resistente non era sufficiente per attivare la risposta della pianta. I tre geni MLO identificati in questo lavoro rappresentano quindi nuovi marcatori di resistenza della vite e possono essere utilizzati per la selezione di piante resistenti all’oidio mediante programmi di miglioramento genetico assistito. Il protocollo per la microdissezione laser ottimizzato in questo studio permette inoltre di aumentare la sensibilità di future analisi trascrizionali e di consentire l’identificazione di nuovi geni marcatori della risposta di difesa della vite all’infezione dei patogeni.

Grapevine (Vitis vinifera) is one of the most economically important fruit crops worldwide, but many cultivars conventionally used for table grape and wine production are susceptible to two several diseases, such as downy mildew (caused by Plasmopara viticola) and powdery mildew (caused by Erysiphe necator). These pathogens are controlled by frequent applications of chemical fungicides to avoid significant losses in yield and berry quality. However, the ecological drawbacks of pesticides and the rapid appearance of resistant pathogen strains have sparked crescent interest in sustainable control alternatives. The development of resistant grapevine hybrids represents a promising option to limit the application of chemical pesticides in viticulture. Thus, a better understanding of the mechanisms responsible for the grapevine defense against downy and powdery mildew and the identification of key resistance genes will help breeding programs to develop resistant varieties. In addition to the resistance genes, the susceptibility genes are key regulators of defense processes in plants, such as the Mildew Locus O (MLO) genes that are known to be responsible for powdery mildew susceptibility in herbaceous plants. Gene expression profiling has been used extensively to investigate regulation processes of the grapevine interaction with mildews and to identify gene markers of the grapevine resistance. However, all studies to date have involved the use of whole leaves, while only a small fraction of host cells is in contact with the pathogen at the early infection stages. Therefore, highly localized transcriptional changes of infected cells may be masked by the large portion of non-infected cells when analyzing the whole leaf.
The final goal of this PhD project was to develop innovative methods for disease control, such as resistant varieties and efficient resistance inducers, based on a better understanding of the key genes and cellular processes involved in the defense and susceptibility mechanisms of the grapevine against downy and powdery mildew. Specific aims were i) to characterize the grapevine response in the sites of downy mildew infection in order to identify site-specific transcriptional regulations in infected stomata, in surrounding areas and in distal part non-infected by the pathogen, and ii) to silence four grapevine MLO genes (MLO-6, MLO-7, MLO-11 and MLO-13) through RNA interference in order to identify the key genes responsible for powdery mildew susceptibility.
For the characterization of the site-specific transcriptional regulations against downy mildew, a laser microdissection protocol was optimized to collect stomata and surrounding cells from leaves of in vitro-grown grapevines at early stages of pathogen infection, and the expression levels of ten genes involved in the grapevine response to downy mildew were investigated by real time PCR. The expression levels of seven P. viticola-responsive genes were greater in microdissected cells than in whole leaves, highlighting the site-specific transcriptional regulation of the host response. The gene modulation was restricted to the stomata cells and to the surrounding areas of infected tissues, indicating that short-distance signals are implicated. The high sensitivity of the laser microdissection analysis showed significant modulations of three genes that were completely masked in the whole tissue analysis.
For the characterization of susceptibility genes, three grapevine lines silenced in the expression of MLO genes showed an increased resistance against powdery mildew. Expression analyses of resistant and susceptible lines demonstrated the key role of the MLO-7 gene in the susceptibility of powdery mildew, with an additive contribution of the MLO-6 and MLO-11 genes. The expression level of thirteen defense-related genes was lower in resistant than in susceptible lines, highlighting an early MLO-dependent reduction of powdery mildew invasion. However, the accumulation of defense-related compounds was comparable in resistance and susceptible lines, suggesting that further analysis are required to better clarify the complex resistance mechanisms against powdery mildew. The protocol for the laser microdissection analysis optimized in this study could greatly increase the sensitivity of further transcriptomic studies to identify new marker genes of the grapevine defense activated at the sites of infection. Specifically, the three MLO genes identified in
this project represent novel markers of grapevine resistance and they could be used for marker-assisted selection in breeding programs of powdery mildew-resistant grapevines.
Description: 
Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare
URI: http://hdl.handle.net/2067/3026
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