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Title: Study of a novel NF-Y/miRNAs network in colon cancer
Other Titles: Studio di un nuovo meccanismo tra NF-Y e miRNA nel tumore al colon
Authors: Falcone, Emmanuela
Keywords: MiRNA;NF-Y;Transcriptional regulation;MicroRNA;Regolazione trascrizionale;BIO/11
Issue Date: 6-May-2016
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 28. ciclo
Abstract: 
During my PhD in “Genetica e Biologia Cellulare” at University of Tuscia (Viterbo), performed at
National Cancer Institute “Regina Elena” in Rome, in Dr. Giulia Piaggio’s group and under the
supervision of Dr. Aymone Gurtner, I focused my research activity on the molecular mechanisms
by which the transcriptional factor NF-Y regulates miRNA expression in colon cancer.
Colorectal cancer (CRC) is one of the major leading causes of cancer-related death. CRC
development and progression involves mutational events in oncogenes and tumor suppressor genes
often accompanied by deregulated gene expression (Schoen et al. 2012).
MiRNAs are small non coding single-stranded RNAs of about 20–25 nucleotides in length that
regulate gene expression by binding to complementary target mRNAs and promoting their decay or
inhibiting their translation (Ha and Kim 2014, Krol et al. 2010). More than 1800 human miRNA
loci and an even greater number of predicted miRNA targets have been identified in the human
genome. Thus, miRNAs are potent regulators of gene expression involved in diverse physiological
processes, such as normal development, differentiation, growth control, apoptosis, and in human
diseases, particularly in cancer where they act as regulators of key cancer-related pathways (Lynam-
Lennon et al. 2009, Lujambio and Lowe 2012).
Deregulation of miRNAs expression has been found in various cancer types among which CRC
(Fabbri et al. 2007, Lujambio and Lowe et al. 2012), thus, miRNAs may be potential targets for
cancer therapy. However, the mechanisms through which miRNAs are regulated in cancer remain
unclear. Therefore, the identification of transcriptional factor–miRNA crosstalk is one of the most
update aspects of the study of miRNAs regulation (Schanen and Li 2011). NF-Y is an ubiquitous
heterotrimeric transcription factor with a high binding affinity for the CCAAT consensus motif that
is one of the most common cis-acting elements found in the promoter and enhancer regions of
protein coding genes in eukaryotes. Growing number of experiments in cells support the notion that
NF-Y complex is a key player in the regulation of proliferation and viability (Gurtner et al. 2003,
Imbriano et al. 2005, Gurtner et al. 2008, Gurtner et al. 2010). Analysis of transcriptome profiles
during cellular transformation identified the CCAAT box as over-represented in promoters of genes
overexpressed in diverse types of cancers, breast, colon, thyroid, prostate and leukemia (Yamanaka
et al. 2009). This strongly indicates the involvement of NF-Y in cancer-associated pathways.
Interestingly, computational studies indicate that a number of known transcriptional factors, among
which NF-Y, could be responsible for the aberrant regulation of 214 human pre-miRNA sequences
in cancer and other diseases (Lee et al. 2007, Goodarzi et al. 2009). However, no experimental data
on miRNA regulation by the transcription factor NF-Y are available until now. Indeed we addressed
whether NF-Y regulates at transcriptional level miRNAs deregulated in CRC, and also we study the
biological implications of the identified NF-Y-miRNAs crosstalk.
- In paper I (Falcone et al. 2016), we developed a software, named infinity, able to find the
presence of transcriptional factor-binding DNA matrices, in 60Kb upstream and 5Kb
downstream of 980 human pre-miRNA, simultaneously. Using this software we found that
the CCAAT sequences, bound by NF-Y, are overrepresented on ~60% of 118 human miRNA
deregulated in CRC in a minimal promoter region between -1 kb to + 0,5kb with respect the
transcription start site (TSS). Of note, some of these miRNAs, such as miR-181a, -181b, -
21, -17, -18a, -20a, -19b, -92a, -301b, -130b, -200a, -200b, -200c, -141, -429, display key
roles on cell proliferation, viability and cell migration on colon cancer (Woods et al. 2007,
Dong et al. 2014, Lin et al. 2014, Pichler et al. 2014, Sun et al. 2015). The power of our
software has been validated in vivo by performing chromatin immunoprecipitation assays
(ChIP) and loss of function experiments on the above mentioned group of miRNAs on
SW480 colon cancer cell line. Our results revealed, for the first time, that NF-Y, through its
CCAAT binding activity, regulates the expression of miRNAs deregulated in colon cancer
cells.
- Paper II (Falcone et al. in preparation). MiRNA-200 family, found deregulated in CRC and
presenting the CCAAT boxes near the TSS, are potent inhibitors of migration, invasion and
metastasis (Humphries and Yang 2015). Indeed we asked whether NF-Y, regulating their
expression at transcriptional level, impacts on colon cancer cell invasion. Firstly, we have
demonstrated, by ChIP, Luciferase assay, loss of function experiments on several colon
cancer lines, that NF-Y regulates at transcriptional levels the miRNA-200 family members.
Furthermore, considering the miRNA-200 family’s role in cancer development and
progression, we have studied the NF-Y implication in cell invasion. To this hand we have
demonstrated that the invasion activity of human colon adenocarcinoma cell lines, is
reduced after NF-Y overexpression while is increased after NF-Y depletion. Moreover, the
expression levels and activity of the matrix metalloproteinase MMP-2, a cancer-associated
secreted zinc-dependent endopeptidases, is increased upon NF-Y depletion. Collectively our
data demonstrated that NF-Y positively regulates a transcriptional level the miRNA-200
family, and consequently inhibits cellular invasion of colon cancer cells.

Durante il mio dottorato di ricerca in "Genetica e Biologia Cellulare" presso l'Università della
Tuscia (Viterbo), svolto all’Istituto Nazionale di Tumori "Regina Elena" di Roma, nel gruppo della
Dr.ssa Giulia Piaggio e sotto la supervisione della Dr.ssa Aymone Gurtner, ho concentrato la mia
attività di ricerca sui meccanismi molecolari con cui il fattore di trascrizione NF-Y regola
l'espressione di miRNA deregolati nel carcinoma del colon e del retto.
Il cancro al colon-retto (CRC) è una delle principali cause di morte per tumore. Lo sviluppo e la
progressione del CRC sono caratterizzate da eventi mutazionali che insorgono nel genoma a carico
di oncogeni e di geni oncosoppressori, responsabili della trasformazione e progressione neoplastica,
spesso accompagnate a degolazione dell’espressione genica (Schoen et al. 2012).
I miRNA sono piccoli RNA non codificanti a singolo filamento, lunghi circa 20-25 nucleotidi, che
regolano l'espressione genica legandosi agli mRNA bersaglio complementari e promuovendone la
degradazione o inibendone la traduzione (Ha e Kim 2014, Krol et al. 2010). Sono stati identificati
nel genoma umano più di 1800 loci genici per i miRNA, e un numero ancora superiore i putativi
bersagli. Ne consegue che i miRNA sono potenti regolatori dell’espressione genica coinvolti in
diversi processi fisiologici, come lo sviluppo, il differenziamento, il controllo della proliferazione,
l'apoptosi, ma anche in processi patologici, come il cancro, dove agiscono come regolatori di
processi molecolari fondamentali nella tumorigenesi (Lynam-Lennon et al. 2009, Lujambio e Lowe
2012). Tutti i tipi di tumore esaminati, tra cui il CRC, sono caratterizzati da una deregolazione
dell’espressione dei miRNA (Fabbri et al. 2007, Lujambio e Lowe et al. 2012). I miRNA sono
quindi considerati dei potenziali bersagli utili nella terapia contro il cancro. Tuttavia, i meccanismi
attraverso i quali i miRNA sono regolati nel cancro rimangono ancora poco chiari. Pertanto,
l'identificazione delle interazioni tra i fattori trascrizionali e i miRNA è un aspetto cruciale per poter
comprendere questi meccanismi (Schanen e Li 2011).
NF-Y è un fattore di trascrizione ubiquitario, eterotrimerico, con alta affinità di legame per la
sequenza consenso CCAAT. Questa sequenza è tra gli elementi più comuni trovati nelle regioni
promotrici e negli enhancer di geni eucariotici che codificano per proteine. Molti esperimenti in
vitro hanno supportato l'idea che il fattore NF-Y abbia un ruolo chiave nella regolazione della
proliferazione e nella vitalità cellulare (Gurtner et al. 2010, Gurtner et al. 2008, Gurtner et al. 2003 ,
Imbriano et al. 2005). L’analisi dei profili del trascrittoma durante la trasformazione cellulare hanno
identificato che le CCAAT box sono presenti in elevato numero nei promotori dei geni sovraespressi
in diversi tipi di tumori, come quello del seno, del colon, della tiroide, della prostata e nelle
leucemie (Yamanaka et al. 2009). Questo suggerisce un forte coinvolgimento di NF-Y nella
tumorigenesi. Inoltre, studi computazionali suggeriscono che vari fattori trascrizionali noti, tra i
quali NF-Y, potrebbero essere responsabili della deregolazione di 214 pre-miRNA umani nel
cancro e in altre patologie (Lee et al. 2007, Goodarzi et al. 2009). Tuttavia, ad oggi non esistono
dati sperimentali che dimostrano il ruolo del fattore NF-Y nella regolazione dell’espressione dei
miRNA. Dunque ci siamo chiesti se e come NF-Y potesse regolare a livello trascrizionale i miRNA
deregolati nel CRC ed abbiamo studiato il ruolo biologico dell’interazione tra NF-Y ed i miRNA
identificati.
- Manoscritto I (Falcone et al. 2016). Al fine di capire se NF-Y fosse un regolatore
trascrizionale dei miRNAs, per prima cosa abbiamo sviluppato un software, chiamato
infinity, in grado di trovare una specifica sequenza consenso per un determinato fattore di
trascrizione, in 60Kb a monte e 5Kb a valle di 980 pre-miRNA umani contemporaneamente.
Usando questo software abbiamo trovato che le sequenze CCAAT, legate dal fattore
trascrizionale NF-Y, sono presenti in elevato numero, nel ~60% dei 118 miRNA umani
deregolati nel CRC, in una regione del promotore compresa tra -1kb e +0,5kb rispetto al sito
di inizio della trascrizione (TSS). E’ interessante notare che alcuni di questi miRNA, come i
miRNA -181 , -181b , -21 , -17 , -18a , -20a , -19b , -92a , -301b , -130b , -200a , -200b , -
200C , -141 , -429, hanno un ruolo chiave nella proliferazione cellulare, nella vitalità e nella
migrazione di cellule di tumore al colon (Woods et al., 2007 , Dong et al. 2014, Lin et al.
2014, Pichler et al. 2014, Sun et al. 2015). Il potere predittivo del nostro software è stato
convalidato tramite esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina in vivo (ChIP) e
con esperimenti funzionali in cellule di cancro al colon, le SW480.. I nostri risultati hanno
rivelato, per la prima volta, che NF-Y, tramite il suo legame alle CCAAT box, regola
l'espressione di miRNA deregolati nelle cellule tumorali di colon.
- Manoscritto II (Falcone et al. in preparazione). Tra i miRNA deregolati nel CRC e
contenenti le CCAAT box in una regione vicina al TSS, c’è la famiglia dei miRNA-200. I
membri di questa famiglia sono potenti inibitori della migrazione, invasione e
metastatizzazione in cellule tumorali (Humphries e Yang 2015). Per tale motivo ci siamo
chiesti se NF-Y, regolandone l’espressione, avesse un ruolo nel processo di invasione
cellulare. Per rispondere a questa domanda per prima cosa abbiamo dimostrato, utilizzando
diversi approcci sperimentali (ChIP, saggi di attività luciferasica, riduzione sia dell’attività
che dell’espressione di NF-Y) in diverse linee cellulari di cancro del colon, che NF-Y,
regola a livello trascrizionale la famiglia dei miRNA-200. Successivamente, abbiamo
dimostrato come diverse linee cellulari di tumore al colon presentino una minore capacità
invasiva dopo overespressione di NF-Y, mentre acquisiscano una maggiore capacità di
invadere dopo deplezione di NF-Y. In accordo, abbiamo dimostrato come i livelli di
espressione e l'attività correlata alla metalloproteinasi MMP-2, un’endopeptidasi associata al
cancro e zinco-dipendente secreta dalle cellule, sono aumentati dopo deplezione di NF-Y.
Collettivamente i nostri dati dimostrano che NF-Y regola positivamente a livello
trascrizionale la famiglia dei miRNA-200, e di conseguenza inibisce l'invasione delle cellule
tumorali del colon.
Description: 
Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare
URI: http://hdl.handle.net/2067/3024
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