Study of a novel NF-Y/miRNAs network in colon cancer

Abstract

During my PhD in “Genetica e Biologia Cellulare” at University of Tuscia (Viterbo), performed at National Cancer Institute “Regina Elena” in Rome, in Dr. Giulia Piaggio’s group and under the supervision of Dr. Aymone Gurtner, I focused my research activity on the molecular mechanisms by which the transcriptional factor NF-Y regulates miRNA expression in colon cancer. Colorectal cancer (CRC) is one of the major leading causes of cancer-related death. CRC development and progression involves mutational events in oncogenes and tumor suppressor genes often accompanied by deregulated gene expression (Schoen et al. 2012). MiRNAs are small non coding single-stranded RNAs of about 20–25 nucleotides in length that regulate gene expression by binding to complementary target mRNAs and promoting their decay or inhibiting their translation (Ha and Kim 2014, Krol et al. 2010). More than 1800 human miRNA loci and an even greater number of predicted miRNA targets have been identified in the human genome. Thus, miRNAs are potent regulators of gene expression involved in diverse physiological processes, such as normal development, differentiation, growth control, apoptosis, and in human diseases, particularly in cancer where they act as regulators of key cancer-related pathways (Lynam- Lennon et al. 2009, Lujambio and Lowe 2012). Deregulation of miRNAs expression has been found in various cancer types among which CRC (Fabbri et al. 2007, Lujambio and Lowe et al. 2012), thus, miRNAs may be potential targets for cancer therapy. However, the mechanisms through which miRNAs are regulated in cancer remain unclear. Therefore, the identification of transcriptional factor–miRNA crosstalk is one of the most update aspects of the study of miRNAs regulation (Schanen and Li 2011). NF-Y is an ubiquitous heterotrimeric transcription factor with a high binding affinity for the CCAAT consensus motif that is one of the most common cis-acting elements found in the promoter and enhancer regions of protein coding genes in eukaryotes. Growing number of experiments in cells support the notion that NF-Y complex is a key player in the regulation of proliferation and viability (Gurtner et al. 2003, Imbriano et al. 2005, Gurtner et al. 2008, Gurtner et al. 2010). Analysis of transcriptome profiles during cellular transformation identified the CCAAT box as over-represented in promoters of genes overexpressed in diverse types of cancers, breast, colon, thyroid, prostate and leukemia (Yamanaka et al. 2009). This strongly indicates the involvement of NF-Y in cancer-associated pathways. Interestingly, computational studies indicate that a number of known transcriptional factors, among which NF-Y, could be responsible for the aberrant regulation of 214 human pre-miRNA sequences in cancer and other diseases (Lee et al. 2007, Goodarzi et al. 2009). However, no experimental data on miRNA regulation by the transcription factor NF-Y are available until now. Indeed we addressed whether NF-Y regulates at transcriptional level miRNAs deregulated in CRC, and also we study the biological implications of the identified NF-Y-miRNAs crosstalk. - In paper I (Falcone et al. 2016), we developed a software, named infinity, able to find the presence of transcriptional factor-binding DNA matrices, in 60Kb upstream and 5Kb downstream of 980 human pre-miRNA, simultaneously. Using this software we found that the CCAAT sequences, bound by NF-Y, are overrepresented on ~60% of 118 human miRNA deregulated in CRC in a minimal promoter region between -1 kb to + 0,5kb with respect the transcription start site (TSS). Of note, some of these miRNAs, such as miR-181a, -181b, - 21, -17, -18a, -20a, -19b, -92a, -301b, -130b, -200a, -200b, -200c, -141, -429, display key roles on cell proliferation, viability and cell migration on colon cancer (Woods et al. 2007, Dong et al. 2014, Lin et al. 2014, Pichler et al. 2014, Sun et al. 2015). The power of our software has been validated in vivo by performing chromatin immunoprecipitation assays (ChIP) and loss of function experiments on the above mentioned group of miRNAs on SW480 colon cancer cell line. Our results revealed, for the first time, that NF-Y, through its CCAAT binding activity, regulates the expression of miRNAs deregulated in colon cancer cells. - Paper II (Falcone et al. in preparation). MiRNA-200 family, found deregulated in CRC and presenting the CCAAT boxes near the TSS, are potent inhibitors of migration, invasion and metastasis (Humphries and Yang 2015). Indeed we asked whether NF-Y, regulating their expression at transcriptional level, impacts on colon cancer cell invasion. Firstly, we have demonstrated, by ChIP, Luciferase assay, loss of function experiments on several colon cancer lines, that NF-Y regulates at transcriptional levels the miRNA-200 family members. Furthermore, considering the miRNA-200 family’s role in cancer development and progression, we have studied the NF-Y implication in cell invasion. To this hand we have demonstrated that the invasion activity of human colon adenocarcinoma cell lines, is reduced after NF-Y overexpression while is increased after NF-Y depletion. Moreover, the expression levels and activity of the matrix metalloproteinase MMP-2, a cancer-associated secreted zinc-dependent endopeptidases, is increased upon NF-Y depletion. Collectively our data demonstrated that NF-Y positively regulates a transcriptional level the miRNA-200 family, and consequently inhibits cellular invasion of colon cancer cells.

Durante il mio dottorato di ricerca in "Genetica e Biologia Cellulare" presso l'Università della Tuscia (Viterbo), svolto all’Istituto Nazionale di Tumori "Regina Elena" di Roma, nel gruppo della Dr.ssa Giulia Piaggio e sotto la supervisione della Dr.ssa Aymone Gurtner, ho concentrato la mia attività di ricerca sui meccanismi molecolari con cui il fattore di trascrizione NF-Y regola l'espressione di miRNA deregolati nel carcinoma del colon e del retto. Il cancro al colon-retto (CRC) è una delle principali cause di morte per tumore. Lo sviluppo e la progressione del CRC sono caratterizzate da eventi mutazionali che insorgono nel genoma a carico di oncogeni e di geni oncosoppressori, responsabili della trasformazione e progressione neoplastica, spesso accompagnate a degolazione dell’espressione genica (Schoen et al. 2012). I miRNA sono piccoli RNA non codificanti a singolo filamento, lunghi circa 20-25 nucleotidi, che regolano l'espressione genica legandosi agli mRNA bersaglio complementari e promuovendone la degradazione o inibendone la traduzione (Ha e Kim 2014, Krol et al. 2010). Sono stati identificati nel genoma umano più di 1800 loci genici per i miRNA, e un numero ancora superiore i putativi bersagli. Ne consegue che i miRNA sono potenti regolatori dell’espressione genica coinvolti in diversi processi fisiologici, come lo sviluppo, il differenziamento, il controllo della proliferazione, l'apoptosi, ma anche in processi patologici, come il cancro, dove agiscono come regolatori di processi molecolari fondamentali nella tumorigenesi (Lynam-Lennon et al. 2009, Lujambio e Lowe 2012). Tutti i tipi di tumore esaminati, tra cui il CRC, sono caratterizzati da una deregolazione dell’espressione dei miRNA (Fabbri et al. 2007, Lujambio e Lowe et al. 2012). I miRNA sono quindi considerati dei potenziali bersagli utili nella terapia contro il cancro. Tuttavia, i meccanismi attraverso i quali i miRNA sono regolati nel cancro rimangono ancora poco chiari. Pertanto, l'identificazione delle interazioni tra i fattori trascrizionali e i miRNA è un aspetto cruciale per poter comprendere questi meccanismi (Schanen e Li 2011). NF-Y è un fattore di trascrizione ubiquitario, eterotrimerico, con alta affinità di legame per la sequenza consenso CCAAT. Questa sequenza è tra gli elementi più comuni trovati nelle regioni promotrici e negli enhancer di geni eucariotici che codificano per proteine. Molti esperimenti in vitro hanno supportato l'idea che il fattore NF-Y abbia un ruolo chiave nella regolazione della proliferazione e nella vitalità cellulare (Gurtner et al. 2010, Gurtner et al. 2008, Gurtner et al. 2003 , Imbriano et al. 2005). L’analisi dei profili del trascrittoma durante la trasformazione cellulare hanno identificato che le CCAAT box sono presenti in elevato numero nei promotori dei geni sovraespressi in diversi tipi di tumori, come quello del seno, del colon, della tiroide, della prostata e nelle leucemie (Yamanaka et al. 2009). Questo suggerisce un forte coinvolgimento di NF-Y nella tumorigenesi. Inoltre, studi computazionali suggeriscono che vari fattori trascrizionali noti, tra i quali NF-Y, potrebbero essere responsabili della deregolazione di 214 pre-miRNA umani nel cancro e in altre patologie (Lee et al. 2007, Goodarzi et al. 2009). Tuttavia, ad oggi non esistono dati sperimentali che dimostrano il ruolo del fattore NF-Y nella regolazione dell’espressione dei miRNA. Dunque ci siamo chiesti se e come NF-Y potesse regolare a livello trascrizionale i miRNA deregolati nel CRC ed abbiamo studiato il ruolo biologico dell’interazione tra NF-Y ed i miRNA identificati. - Manoscritto I (Falcone et al. 2016). Al fine di capire se NF-Y fosse un regolatore trascrizionale dei miRNAs, per prima cosa abbiamo sviluppato un software, chiamato infinity, in grado di trovare una specifica sequenza consenso per un determinato fattore di trascrizione, in 60Kb a monte e 5Kb a valle di 980 pre-miRNA umani contemporaneamente. Usando questo software abbiamo trovato che le sequenze CCAAT, legate dal fattore trascrizionale NF-Y, sono presenti in elevato numero, nel ~60% dei 118 miRNA umani deregolati nel CRC, in una regione del promotore compresa tra -1kb e +0,5kb rispetto al sito di inizio della trascrizione (TSS). E’ interessante notare che alcuni di questi miRNA, come i miRNA -181 , -181b , -21 , -17 , -18a , -20a , -19b , -92a , -301b , -130b , -200a , -200b , - 200C , -141 , -429, hanno un ruolo chiave nella proliferazione cellulare, nella vitalità e nella migrazione di cellule di tumore al colon (Woods et al., 2007 , Dong et al. 2014, Lin et al. 2014, Pichler et al. 2014, Sun et al. 2015). Il potere predittivo del nostro software è stato convalidato tramite esperimenti di immunoprecipitazione della cromatina in vivo (ChIP) e con esperimenti funzionali in cellule di cancro al colon, le SW480.. I nostri risultati hanno rivelato, per la prima volta, che NF-Y, tramite il suo legame alle CCAAT box, regola l'espressione di miRNA deregolati nelle cellule tumorali di colon. - Manoscritto II (Falcone et al. in preparazione). Tra i miRNA deregolati nel CRC e contenenti le CCAAT box in una regione vicina al TSS, c’è la famiglia dei miRNA-200. I membri di questa famiglia sono potenti inibitori della migrazione, invasione e metastatizzazione in cellule tumorali (Humphries e Yang 2015). Per tale motivo ci siamo chiesti se NF-Y, regolandone l’espressione, avesse un ruolo nel processo di invasione cellulare. Per rispondere a questa domanda per prima cosa abbiamo dimostrato, utilizzando diversi approcci sperimentali (ChIP, saggi di attività luciferasica, riduzione sia dell’attività che dell’espressione di NF-Y) in diverse linee cellulari di cancro del colon, che NF-Y, regola a livello trascrizionale la famiglia dei miRNA-200. Successivamente, abbiamo dimostrato come diverse linee cellulari di tumore al colon presentino una minore capacità invasiva dopo overespressione di NF-Y, mentre acquisiscano una maggiore capacità di invadere dopo deplezione di NF-Y. In accordo, abbiamo dimostrato come i livelli di espressione e l'attività correlata alla metalloproteinasi MMP-2, un’endopeptidasi associata al cancro e zinco-dipendente secreta dalle cellule, sono aumentati dopo deplezione di NF-Y. Collettivamente i nostri dati dimostrano che NF-Y regola positivamente a livello trascrizionale la famiglia dei miRNA-200, e di conseguenza inibisce l'invasione delle cellule tumorali del colon.