Caratterizzazione del rischio da esposizione a β-esaclorocicloesano (β-HCH) mediante modelli cellulari animali

Abstract

Nella classe di composti denominati “Interferenti Endocrini” (IE) ritroviamo il Lindano, l’isomero γ- dell’esaclorocicloesano (γ-HCH), e gli altri isomeri dell’HCH (α-HCH; β-HCH; δ-HCH; ε-HCH). L’HCH è un insetticida ampiamente usato sino alla fine degli anni ’80, ormai vietato in Europa e negli USA, ma che continua ad essere oggetto di preoccupazione, in quanto alcune sue tracce persistono nell’ambiente e negli alimenti. Tra gli isomeri, il β-HCH risulta essere il più stabile ed il meno degradabile, sia nell’ambiente che nei tessuti umani ed animali nei quali può accumularsi in seguito ad esposizione. La contaminazione da β-HCH che ha coinvolto una vasta area della Valle del Fiume Sacco (province di Roma e Frosinone, Lazio, Italia), ha causato ingenti danni nei sistemi agro-zootecnici locali, riportando all’attenzione dell’opinione pubblica nazionale e regionale, problematiche circa l’inquinamento agro-ambientale e la sicurezza alimentare. Residui di β-HCH, sono stati ritrovati nel periodo 2005-2006, in campioni di latte e di siero ematico provenienti da allevamenti di bovini da latte collocati lungo il Fiume Sacco. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di monitorare gli effetti del β-HCH su modelli cellulari animali e umani, con l’obiettivo di stimare il rischio d’esposizione sia per gli animali da reddito che per gli operatori del settore agricolo-zootecnico dell’area. Sulla base dei dati pubblicati in merito allo stato di contaminazione della Valle del Fiume Sacco, e sulla base degli studi effettuati in precedenza, sono stati scelti due modelli cellulari per studiare gli effetti in vitro del β-HCH sul sistema immunitario animale e umano. I modelli cellulari utilizzati sono stati: le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di bovino, una popolazione eterogenea di cellule costituita da linfociti T, linfociti B e monociti, e le cellule linfocitarie umane Jurkat, popolazione immortalizzata e omogenea, costituita solamente da linfociti T. I test in vitro utilizzati in questo studio sono stati: il Trypan Blue Exclusion (TBE) test, per monitorare in numero di cellule vive; il test XTT, per monitorare l’attività metabolica cellulare; il test di proliferazione cellulare basato sull’incorporazione della Bromodeossiuridina (BrdU) (solo su PBMC bovine); il test del rilascio della lattato deidrogenasi (LDH); il test della Diclorofluoresceina Diacetato (DCF-DA) per la quantificazione dei ROS intracellulari; i test colorimetrici per monitorare l’attività dei principali enzimi di detossificazione quali la Superossido Dismutasi (SOD), la Catalasi (CAT) la Gutahione Perossidasi (Gpx) e la Glutatione-S-Trsferasi (GST) e la real-time-PCR (rt-PCR) per monitorare l’espressione genica degli enzimi di detossificazione. Il range di concentrazioni di β-HCH testato (β-HCH 0,1-1-10-100-1000 μM), è stato scelto sulla base sia degli studi già effettuati in precedenza, sia delle concentrazioni ritrovate in vivo nei bovini della Valle del fiume Sacco. Il piano sperimentale ha previsto due tempi di incubazione, 2 giorni (esposizione acuta) e 7 giorni (esposizione sub-cronica). I risultati ottenuti hanno dimostrato che, il β-HCH è in grado di indurre un aumento dell’attività metabolica (test XTT) nelle PBMC bovine e nelle Jurkat esposte a β-HCH 1 μM, dopo 2 giorni di incubazione. Invece, dopo 7 giorni di incubazione, e alle concentrazioni più alte (β-HCH 10-100-1000 μM), è stata osservata una diminuzione dell’attività metabolica cellulare. I risultati ottenuti hanno mostrato che, il β-HCH induce un aumento delle stress ossidativo cellulare, sia nelle PBMC bovine che nelle cellule linfocitarie umane Jurkat, ad entrambi i tempi di incubazione. In particolare, nelle PBMC è stato osservato un aumento dello stress ossidativo anche alle concentrazioni di β-HCH paragonabili a quelle ritrovate in vivo nei bovini allevati nella Valle del Sacco (β-HCH 0,1-1 μM). Inoltre, in entrambi i tipi cellulari, è stato osservato un cambiamento dell’attività dei principali enzimi di detossificazione (SOD, CAT, Gpx, GST) rispetto al controllo, anche se la risposta enzimatica varia in base al tipo cellulare. Al contrario, non è stata osservata l’attivazione di meccanismi più complessi come l’attivazione della trascrizione genica dei principali enzimi di detossificazione (SOD; GST; CAT; Gpx), tranne che nelle PBMC bovine esposte alle concentrazioni più alte (β-HCH 100 e 1000 μM), dopo 7 giorni d’esposizione. Dai risultati ottenuti dal test LDH, non sono state osservate differenze significative nel rilascio nel mezzo extracellulare di LDH, in entrambi i tipi cellulari. Infine, il test della BrdU, effettuato solo sulle PBMC bovine, ha evidenziato una diminuzione dell’attività proliferativa nelle cellule stimolate sia con il Pokeweed (PWM), che con la Concavalina A (Con A), esposte alla più alta concentrazione di β-HCH (1000 μM), ad entrambi i tempi di incubazione. Al contrario, le PBMC esposte a β-HCH nel range di concentrazione 0,1-100 μM hanno mostrato una variabilità della risposta cellulare sulla base del mitogeno utilizzato. In particolare, nelle PBMC di bovino stimolate con il mitogeno PWM, è stata osservata una diminuzione dose-dipendente dell’attività proliferativa cellulare, soltanto dopo 2 giorni di incubazione. Al contrario, nelle PBMC stimolate con la Con A, dopo 2 giorni di incubazione, è stato osservato un aumento dell’attività proliferativa solo nelle cellule trattate con β-HCH 100 μM. Sulla base di questi risultati possiamo affermare che, il β-HCH induce, sia nelle cellule del sistema immunitario bovino, che nelle cellule linfocitarie umane, in vitro, un aumento delle stress ossidativo cellulare, anche alle dosi paragonabili a quelle ritrovate in vivo nel caso della Valle del Sacco. Inoltre il β-HCH è in grado di indurre una risposta cellulare, sia a livello di attività metabolica, ma soprattutto a livello di attività dei principali enzimi di detossificazione, al fine di riportare la cellula in uno stato di omeostasi ossidativa Gli obiettivi futuri sono quelli di monitorare la presenza/assenza di markers della perossidazione lipidica come la malondialdeide (MDA), ed il meccanismo alla base dell’interazione tra il β-HCH e le cellule del sistema immunitario. Infine, sarebbe interessante confermare l’ipotesi di attivazione del pathways di morte cellulare per apoptosi.

The β-hexachlorocyclohexane (β-HCH) is a very stable and accumulable isomer of Lindane, a well-known organochlorine pesticide. The HCHs are banned in all developed countries but to date, high concern still exists for the environment, animal and human health due to contaminated sites. Nowadays, the indirect environmental contamination by OCPs is mainly due to the illegal and/or wrong accumulation of wastes in industrial areas. In 2006, a rural area in Italy devoted to dairy cow farming (the Sacco River Valley, Lazio Region), was found to be contaminated by HCHs: in particular, the β-HCH was found in soil, forages and cow milk as well as in sapwood and bark of poplars growing near the Sacco River. In addition, the β-HCH was found in blood serum of the cows farmed in that area. The aim of this work was monitoring the effects of the β-HCH on human and animal cell models, to estimating the risk of exposure for both farm animals and operators of the agro-livestock sector. Two type of immune cells were selected for this study: the bovine Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) and a specific type of immune cells (human T lymphocytes), called Jurkat. The range of β-HCH (from 0.1 to 1000 μM) was chosen on the basis of previous studies and on the basis of β-HCH levels found in vivo on bovine reared in the Sacco River Valley. All the trials were performed incubating PBMCs and Jurkat for 2 and 7 days. In this study, in vitro tests used to monitoring effects of β-HCH were the following: cell viability test (XTT test); Trypan Blue Exclusion (TBE) assay, for monitoring the number of living cells; Lactate Dehydrogenase (LDH) release assay; Bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation assay, for monitoring the proliferation cells activity; Dichorodihydrofluorescein Diacetate (DCHF-DA) assay, for monitoring the intracellular reactive oxygen species concentration; real-time PCR (rt-PCR) for monitoring the mRNA expression of Superoxide Dismutase (SOD), Catalase (CAT), Glutathione Peroxidase (Gpx) and Glutathione-S-Transferase (GST)). The metabolic activity of bovine PBMCs and Jurkat cells increased at 2 days of exposure only in cells exposed to β-HCH 1 μM; instead, after 7 days of exposure, and at higher concentrations of β-HCH (10-100-1000 μM), a decrease of metabolic activity was observed. Results obtained by the DCFH-DA assay showed an increase of Reactive Oxygen Species on bovine PBMCs and Jurkat exposed to β-HCH, both after 2 days of exposure and after 7 days of exposure, also at concentration levels (β-HCH 0.1-1 μM) comparable to those found in vivo in blood serum of cows reared in the Sacco River Valley. Besides, it was observed an increase of activity of detoxification enzymes (SOD, CAT, Gpx, and GST), both on bovine PBMCs and Jurkat cells. The increase of expression of mRNA of SOD, CAT, Gpx and GST was observed only on bovine PBMCs exposed to β-HCH 100 and 1000 μM, after 7 days of exposure. The LDH assay results suggest that, β-HCH does not clearly affect the integrity of the cell membrane in the range of exposure levels tested. The BrdU incorporation assays showed rather different results according to the different mitogens and times of exposure; only the highest concentration of β-HCH (1000 μM) induce a decrease of proliferation activity of PBMCs stimulated by PWM and Con A at both incubation time. Instead, PBMCs stimulated with PWM, exhibited a gradual reduction of proliferative activity from 0.1 μM to 100 μM β-HCH, only after 2 days of exposure. A rather different picture has been observed stimulating PBMCs with the mitogen ConA. After 2 days of exposure, no effects have been observed in PBMCs exposed to β-HCH 0.1-100 μM. Instead, after 7 days of incubation, it was seen a decrease of the proliferative capacity of PBMCs exposed to 100 μM β-HCH. On the basis of these results, we can affirm that, the β-HCH induces, both in cells of the bovine immune system, that in human lymphocyte cells, in vitro, an increase of cellular oxidative stress, even at doses comparable found in vivo in in blood serum of cows reared in the Sacco River Valley. Furthermore, the β-HCH is able to induce a cellular metabolic activity response, and an activation of main detoxifying enzymes, to bring the cell in a state of oxidative homeostasis. Future objectives are to monitor the presence / absence of markers of lipid peroxidation such as malondialdehyde (MDA), and the mechanism of interaction between the β-HCH, and the immune system cells. Finally, it would be interesting to confirm the hypothesis of activation of cell death pathways for apoptosis.