Pectin methyl-esterases (PMEs) in wheat: genome-wide characterization and their role in wheat-Fusarium graminearum interaction

Abstract

Pectin methyl esterase (PME) genes code for enzymes that are involved in structural modifications of the plant cell wall, in plant development and they are also involved in plant-pathogen interaction. PME genes belong to a multigene family in plants, both in dicotyledonous and monocotyledonous species. So far there is a limited knowledge about PMEs in wheat, consequently in this work a genome-wide search was performed on the recently available wheat genome. Forty complete PME sequences and 4 incomplete sequences, 2 of which have been subsequently completed from the bread wheat cv. Bobwhite, were identified. Structural analysis revealed that exon-intron structure is conserved between homoeologous genes sharing a high sequence identity. Expression analysis of PME genes in different bread wheat tissues showed a diverse expression pattern in those tissues and developmental stages analyzed. Most of the members of this gene family underwent a down-regulation following the opening of the florets to perform infection with Fusarium graminearum by using the point inoculation method. Following infection, the expression behavior of specific PME genes was markedly different in the FHB-resistant wheat genotype Sumai3 in comparison to the susceptible cv. Bobwhite, being more strongly induced in the latter than in the former, thus suggesting a possible involvement of PME genes in FHB susceptibility. TRI6 gene of F. graminearum was used to quantify the fungal biomass in three different portions of the spike: the central spikelets directly infected and the upper and lower spikelets respect to the central ones. These analysis showed the presence of the pathogens in the central and upper spikelets and its absence in the lower spikelets. The analysis of PME genes expression in the different parts of the spike showed that the presence of the pathogen in the upper spikelets is associated with an increase of the expression of specific PMEs at 48 hour post infection (hpi). Conversely, in the lower spikelets a down-regulation of PME genes was observed, possibly as result of the stress generated by the opening of the central spikelets for the infection. These preliminary analysis lead us to the identification of those PMEs that could be involved in the susceptibility or resistance in wheat. In order to validate our results and hypothesis, three selected PMEs (PME13, PME21 and PME28) were silenced through RNA interference. Two transgenic lines each silenced for PME13 or PME28 were subjected to a preliminary infection experiment with F. graminearum, but no significant differences were found between the transgenics and the control plants, except between AZ4-11 transgenic line and Svevo plants at 2 days post infection (DPI) . Silenced PME genes were also searched by a TILLING approach, by screening a durum wheat TILLING population of 4000 plants available at the University of Tuscia. However, the screening of 1920 samples for mutations in the PME13 gene did not identify any silenced genotype. We screened also the recent available TILLING population database developed by the University of California, Davis. We found 28 mutated accessions for 12 different PME genes: STOP codons were found in 18 accessions and splicing sites mutations were found in the remaining 10 accessions. In conclusion, this genome-wide study of wheat PMEs revealed structural and functional characteristics of this gene family and highlighted the possible involvement of specific PME in wheat-F. graminearum interaction. Silencing of PME13 and PME28 did not modify wheat resistance against F. graminearum in the preliminary infection experiment. However, the selected TILLING mutants for additional PME genes will represent the basis for further study to verify the involvement of PMEs in wheat-pathogen interaction.

Le pectin metil esterasi (PME) codificano enzimi coinvolti in molteplici funzioni, come modificazioni strutturali della parete cellulare, sviluppo della pianta, interazione pianta-patogeno. I geni PME appartengono ad una famiglia multigenica, sia in monocotiledoni che dicotiledoni. Data la mancanza di informazioni riguardo le PME in frumento, lo scopo di questo lavoro è stato quello di studiare e caratterizzare i geni appartenenti a questa famiglia genica utilizzando il recente database di sequenze del genoma di frumento. Sono state identificate 40 sequenze PME complete e 4 incomplete, 2 delle quali sono state sequenziate dalla cv. di frumento tenero Bobwhite. Le analisi strutturali rivelano che la struttura esoni-introni è conservata tra geni omeologhi con elevata identità di sequenza. Le analisi di espressione delle PME in diversi tessuti di frumento tenero rivelano un differente pattern di espressione nei tessuti e stadi di sviluppo analizzati. La maggior parte dei membri di questa famiglia genica mostra una repressione a seguito dell’apertura del fiore realizzata per effettuare l’infezione con F. graminearum impiegando il metodo del “point inoculation”. A seguito dell’infezione, il comportamento di specifici geni PME è differente tra la cv. resistente Sumai3 e la cv. suscettibile Bobwhite, essendo più fortemente indotti in quest’ultima rispetto alla prima, suggerendo così un possible coinvolgimento degli stessi nella suscettibilità al patogeno. Il gene TRI6 di F. graminearum è stato impiegato per la quantificazione della biomassa fungina in tre differenti porzioni della spiga: le spighette centrali direttamente inoculate e le spighette sopra e sotto il sito di infezione. Queste analisi hanno rilevato la presenza del patogeno nelle spighette centrali e superiori e la sua assenza in quelle inferiori. L’analisi di espressione dei geni PME nelle tre diverse porzioni della spiga ha mostrato che la presenza del patogeno nelle spighette superiori è associata a un aumento dei livelli di espressione di specifiche PME 48 ore dopo l’infezione. Al contrario, nelle spighette inferiori è stata osservata una repressione delle PME, probabilmente a causa dello stress dovuto all’apertura dei fiori delle spighette centrali. Queste analisi hanno permesso di identificare le PME potenzialmente coinvolte nella suscettibilità o resistenza. Per validare i risultati e le ipotesi, sono stati silenziati tre geni PME (PME13, PME21 e PME28) mediante “RNA interference”. Due linee transgeniche silenziate nel gene PME13 o PME28 sono state sottoposte ad un esperimento preliminare di infezione con F. graminearum, ma non sono state riscontrate differenze significative tra le linee transgeniche e quella controllo, ad eccezione della linea transgenica AZ4-11 e Svevo 2 giorni dopo l’infezione. Geni PME silenziati sono stati ricercati anche tramite approccio TILLING, analizzando una popolazione di 4000 piante disponibile presso l’Università della Tuscia. Tuttavia, l’analisi effettuata su 1920 individui per mutazioni nel gene PME13 non ha identificato nessuna mutazione. Quindi, si è proceduto con lo screening di una popolazione TILLING completamente sequenziata recentemente messa a disposizione dall’Università della California, Davis. In questo caso, sono state identificate 28 accessioni mutate per 12 differenti geni PME: 18 accessioni recanti mutazioni per codoni di STOP e 10 accessioni con mutazioni nei siti di splicing. In conclusione, questo studio di caratterizzazione dei geni PME in frumento ha rivelato caratteristiche strutturali e funzionali della famiglia genica, sottolineando un possibile coinvolgimento di specifiche PME nell’interazione frumento-F. graminearum. La verifica di questo possibile coinvolgimento tramite le piante silenziate nel gene PME13 o PME28 non ha evidenziato alcuna differenza con le piante controllo, almeno nel primo esperimento d’infezione. La selezione dei mutanti TILLING per altri geni PME offre la possibilità di indagare più estesamente il coinvolgimento delle PME nell’interazione del frumento con microrganismi patogeni.