Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2986
Title: Structural analysis of endogenous bioactive peptides
Other Titles: Analisi strutturale di peptidi bioattivi endogeni
Authors: Olivieri, Cristina
Keywords: IDPs;AMP;PKA;PKI;NMR;Fluorescence;Chionodracine;Proteina chinasia;Fluorescenza;Chionodracina;CHIM/02
Issue Date: 22-Jun-2016
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 28. ciclo
Abstract: 
Intrinsically disordered proteins (IDPs) are proteins that do not fold into a stable globular structure but are biological active. These proteins are involved in regulation, recognition, and signaling process, where high-specificity/low affinity interactions with multiple partners are fundamental prerequisites. In the last thirty years, a class of small peptides, knowns as antimicrobial peptides (AMPs), similar to IDPs but involved in eukaryotic innate immune response against pathogen infections, have been the subjects of several studies to understand their mechanism of action and to discover and/or develop new antimicrobial substances, that can be used as antibiotic.
In the following PhD thesis we elucidate the structure, mechanism and function of several peptides which are characteristic of AMPs and IDPs. In particular, we determined the structure and function of the AMP Chionodracine (CND). We demonstrated that CND can bind to membranes of different lipid compositions with a preference for membranes mimicking those of prokaryotic cells. We also observed that upon the binding with phospholipid vesicles, the peptide remains adsorbed at the lipid surface, only partially exposed to the aqueous environment. In aqueous solution, the peptide is unfolded but undergoes to disorder-to- order transition, upon binding with phospholipid membranes. Based on the promising results obtained for CND, we designed three different CND mutants, with increased net positive charge and hydrophobicity, and characterized their interaction with synthetic and natural membranes. We characterized the mutant’s activity and function in presence of different phospholipid membranes. These studies demonstrated that the mutations have increased antimicrobial properties of CND. The mutants showed a stronger ability to interact, bind and disrupt membranes of different lipid compositions that can be directly correlated to the number of positively charged amino acids present in the sequence.
The heat-stable Protein Kinase Inhibitor (PKI) is a fully disordered 75 amino acid that regulate the activity and the intracellular localization of catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase A (PKA-C). To understand the molecular mechanism underlying recognition of PKA-C by PKI, we characterized the change in the conformational landscape that PKI undergoes upon binding to PKA-C (Apo to PKA-C bound). These studies were carried out using NMR spectroscopy, the only structural technique to provide atomic resolution detail on IDPs. Using chemical shift analysis and nuclear spin relaxation experiments, we demonstrated that PKI alone has minimal secondary structural elements with only two transient helixes. However, paramagnetic relaxation enhancement (PRE) experiments show that PKI is not fully disordered, but has transient tertiary intramolecular interaction between the C- and N-terminus. When PKI is bound to the kinase, in the presence of the non-hydrolysable ATP mimic, β,γ-Imidoadenosine 5′-triphosphate (ATPN), only the sequence that directly interacts with the PKA-C undergoes significant structural rearrangement while the majority of the peptide is still unfolded.

Le proteine intrinsecamente disordinate (intrinsically disordered proteins – IDPs) sono catene proteiche che, diversamente dalle proteine globulari, sebbene non assumano una struttura tridimensionale, sono biologicamente attive. Le IDPs sono coinvolte in processi di regolazione, riconoscimento e segnalazione cellulare, dove interazioni ad alta affinità/ bassa specificità con partner multipli sono un prerequisito fondamentale. Negli ultimi trent’anni una classe di piccoli peptidi ad attività antimicrobica (antimicrobial peptides - AMPs), componenti fondamentali della risposta immunitaria eucariotica contro infezioni batteriche, e simili per alcune caratteristiche alle IDPs ma, sono diventati l’oggetto di studi finalizzati alla comprensione del loro meccanismo di azione e all’individuazione e/o implementazione di nuove sostanze and attività antimicrobica da utilizzare come alternativa ai comuni antibiotici.
Nel seguente lavoro di tesi di dottorato, abbiamo elucidato la struttura, i meccanismi e la funzione di diversi peptidi appartenenti alle famiglie proteiche sopra citate. In particolare, abbiamo descritto e caratterizzato la struttura e l’attività del peptide antimicrobicoChionodracine (CND). In particolare abbiamo dimostrato che CND interagisce con membrane di diversa composizioni lipidica, prediligendo comunque le membrane la cui composizione fosfolipica mima quella delle membrane procariotiche. A seguito del legame con vescicole fosfolipidiche, il peptide si distribuisce sulla superficie del doppio strato lipidico. In soluzione acquosa, il peptide non ha una struttura tridimensionale definita mentre, in presenza di membrane fosfolipidiche, si organizza in una α-elica amfipatica. Sulla base degli studi effettuati su CND, abbiamo progettato tre diversi peptidi, aventi una maggiore carica positiva e idrofobicità rispetto al peptide wild-type. Come effettuato per CND, anche per i mutanti abbiamo caratterizzato l’attivitàdi interazione con le membrane, utilizzando organismi batterici modello, e vescicole lipidiche la cui composizione lipidica mimava quelle delle membrane procariotiche ed eucariotiche. Gli studi hanno dimostrato che le mutazioni introdotte hanno aumentato sia la capacità di interagire con le membrane modello dei mutanti. In particolare i peptidi mostrano una maggiore capacità di interazione, legame e rottura delle membrane di diversa composizione lipidica,
PKI (heat-stable Protein Kinase Inhibitor) è un peptide costituito da 75 aminoacidi, non strutturato in soluzione, che regola l’attività e la localizzazione cellulare della sub-unità catalitica della proteina chinasi A (PKA-C). Al fine di comprendere il meccanismo molecolare alla base del riconoscimento di PKA-C da parte di PKI, abbiamo caratterizzato i cambiamenti conformazionali subiti da PKI a seguito del legame con l’enzima. Questi studi sono stati effettuati utilizzando la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), che è l’unica tecnica che fornisce informazioni dettagliate a livello atomico sugli IDPs. Utilizzando l’analisi dei chemical shifts ed esperimenti di nuclear spin relaxation, siamo stati in grado di dimostrare che PKI, da solo, presenta elementi minimi di strutture secondarie, con due eliche transitorie. Tuttavia, gli esperimenti di paramagnetic relaxation enhancement (PRE) hanno mostrato che PKI non è completamente disordinata in soluzione, bensì sono presenti interazioni terziare transienti tra la porzione N- e C-terminal. Una volta legata a PKA-C, in presenza di un analogo non idrolizzabile dell’ATP (ATPN), le porzioni del peptide che subiscono una arrangiamento strutturale sono quelle che direttamente interagiscono con la chinasi, mentre la maggior parte del peptide rimane non strutturato.
Description: 
Dottorato di ricerca in Scienze ambientali
URI: http://hdl.handle.net/2067/2986
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