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Title: Nanoscale investigation of environmental and biomedical systems by scanning probe microscopy
Other Titles: Indagini sulla nanoscala di sistemi ambientali e biomedici tramite microscopia a scansione di sonda
Authors: Coppari, Emilia
Keywords: Scanning Probe Microscopes;Nanomedicine;Nanotechnology;Environmental sciences;Microscopia a scansione di sonda;Nanomedicina;Nanotecnologia;Scienze ambientali;FIS/07
Issue Date: 22-Jun-2016
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 28. ciclo
Nanoscience and nanotechnology have revolutionized the way to study and approach the matter. They allowed to investigate complex macromolecular phenomena at the smallest level at which the nature acts, disclosing physicochemical properties completely different at a greater scale. Indisputable protagonists of these scientific progresses were the Scanning Probe Microscopes (SPMs), powerful and advanced techniques able to provide surface topographies with unprecedented resolution as well as unveil a variety of properties of molecular based-structures down to the subnanometer regime and get detailed information about forces, energies and dynamics of biomolecular interactions, working in near native conditions and without labels. SPMs compose a family of techniques, made up by the Scanning Tunneling Microscope (STM) and the Atomic Force Microscope (AFM), which rely their mode of operation on the scanning of a sharp probe (i.e., tip) over the sample surface, monitoring its movements with a subnanometer accuracy through a piezoelectric scanner and maintaining constant the tip-sample distance by using a feedback loop. AFM is able to measure interatomic forces between a sharp tip located at the free end of a spring cantilever and the sample surface with a picoNewton sensitivity. Such an ability makes AFM suitable for very sophisticated applications, by using the cantilever for measuring biomolecular interactions in Atomic Force Spectroscopy (AFS) modality, getting detailed information about biorecognition processes, nanomechanics of samples as viruses or cells, stretching of polymers or proteins and detecting morphological and functional modifications of samples induced by drug treatments or exposure to pollutants.
Therefore, over the years, such a microscope evolved from a qualitative imaging tool to a probe for the achievement of more ambitious goals in biology and nanotechnology as the development of microinstruments for sensing applications, and definitely for pursuiting progresses in life sciences. In this context is focused this thesis, within which molecular systems with environmental, biomedical and nanotechnological relevance are investigated at nanoscale levels in order to disclose fascinating properties with actual application potential.
In Chapters 3 and 4, the p53 superfamily of proteins is the object of two distinct nanotechnological investigations. Such a family of proteins has a central role in maintaining the genome stability and preventing cancer development. Particularly, p53, also called the “guardian of genome”, and the other two components of the family, p63 and p73, control crucial processes as cellular proliferation, death and apoptosis. Recently, it has been demonstrated that in the great majority of human cancers p53 is mutated, thus perturbing and disrupting its functions. In these conditions, the p53 antitumoral activity is partially carried out by p63 and p73. Therefore, probing the effect of existing anticancer
drugs on p63 and p73 in aberrant cells carrying degenerated forms of p53, becomes crucial for implementing innovative treatments. Chapter 3 reports an extensive study on the interaction between p63 and p73 with an antitumorigenic peptide, p28, already known for being able to increase the intracellular levels and the activity of p53 by inhibiting its degradation. We probed the binding process between these proteins by carrying out a careful investigation in which AFS experiments were coupled with more traditional biomolecular assays and molecular modeling simulations, with the aim to outline a complete kinetic and affinity profile of these biorecognition processes, useful to better understand the mechanism of action of p28 and the role of p63 and p73 as antitumoral agents, comparing the results with those obtained for the complex between p28 and p53. In Chapter 4, such a superfamily is the object of another interesting study, concerning the biorecognition process between a mutated form of p53 (R175H) and the full length protein of p73. This interaction deserves particular interest since it causes the inactivation of p73 in cancerous cells, thus determining an increase of the resistance to chemotherapies and of tumor aggressiveness. Hence, such a complex becomes an ideal target for novel selective drugs, which could inhibit or dissociate the binding. On such basis, a kinetic investigation of the biorecognition process between mutant p53 and p73 was conducted in order to probe the interaction at a single molecular level by AFS and in bulk conditions through SPR, obtaining a thorough knowledge of the binding process, thus extrapolating how strong and stable was the interaction.
The high versatility and the application potential of AFM enabled us to access to the mechanical properties of nanoparticles derived from a very interesting plant virus, Tomato Bushy Stunt virus. In fact, virus-derived nanoparticles (VNPs) have recently been considered as a new class of natural biomaterials intriguing for being relevant in material sciences, biomedicine and nanotechnology, due to the regular structures and homogeneity of particles size, ease of production, stability and enormous adaptability to the environment. TBSV shows a very attractive capability to undergo structural phase transitions, mainly controlled by pH and calcium ions concentration, that make accessible its inner cavity and seem to be related to key stages of the viral life-cycle. Chapter 5 deals with a nanoscale investigation on the effects that pH and calcium ions concentration have on the mechanics and stability of TBSV, by performing AFM-based nanoindentation experiments on TBSV-NPs in different environmental conditions. TBSV-NPs proved to be stable and resistant to physical and chemical stresses, such as the impact of the AFM tip in near physiological conditions and the sequestration of calcium ions or pH variations, thus identifying TBSV-NPs as malleable platforms for cargo transportation at the nanoscale.
Lastly, AFM is applied for proving the efficacy and the relevance of a biomolecular system employed for realizing ultrasensitive detection platforms. In the last years, indeed, SPMs were
increasingly used for the design and optimization of such devices, due to their ability to probe individual interactions, reproduce the morphology of surfaces and provide the electrical, chemical and optical properties. In Chapter 6, we follow the interaction between an antigen-antibody pair (β2-microglobulin and its monoclonal antibody) down to the single molecule level, performing a nanoscale visualization of the biomolecular complex on a solid support, disclosing the possible binding geometries, and getting insights into the kinetics of the interaction through AFS and SPR experiments. The coupling of these advanced techniques allowed us to extensively characterized the biorecognition process between these biopartner on the solid surface, gaining crucial insights for innovative and ultrasensitive immune-based, label-free biosensor devices.
The results reported in this thesis highlight the high versatility and the huge application potential of SPM nanotechnologies, which encourage future innovations and advances in different research fields, carrying towards the implementation and development of valuable diagnostic strategies, targeted therapeutic treatments and innovative environmental monitoring devices, also revealing the close connection between environmental stresses and human health risks.

L’avvento di nanoscienze e nanotecnologie nel mondo scientifico ha rivoluzionato il modo di approcciare e studiare la materia. La possibilità di investigare le proprietà di complessi sistemi macroscopici fino alla più bassa scala a cui la natura agisce, attraverso la progettazione e messa in opera di sofisticati dispositivi, ha consentito di rivelare e monitorare proprietà chimico-fisiche che risultano completamente diverse su scala maggiore. Indiscutibili protagonisti di tali progressi scientifici sono sicuramente i microscopi a scansione di sonda (SPM), i quali hanno cambiato la nostra percezione del mondo. Infatti, grazie alla loro capacità di operare a livello della singola molecola, gli SPM sono rapidamente diventati essenziali strumenti di ricerca, in quanto capaci di caratterizzare individuali atomi e molecole, permettendo di evincerne la stretta relazione con l’ambiente circostante. I componenti di questa famiglia di tecniche nacquero principalmente come sofisticati strumenti per la visualizzazione (imaging) delle superfici di campioni di varia natura, in grado di produrre immagini a risoluzione sub-nanometrica e di lavorare in ambiente acquoso, quindi in condizioni prossime a quelle fisiologiche, senza la necessità di utilizzare marcatori e con quantità minime di campione. Il loro principio di funzionamento si basa sulla misura di interazioni fisiche a campo vicino tra una sonda appuntita e gli atomi della superficie del campione sotto analisi, sopra cui la sonda viene fatta correre. Gli spostamenti vengono monitorati con un’accuratezza sub-nanometrica nelle tre dimensioni dello spazio attraverso uno scanner piezoelettrico e, tramite un circuito di retroazione, la distanza tra la sonda e la superficie del campione viene mantenuta costante.
Il microscopio di forza atomica (AFM), membro di questa famiglia di tecniche e subito diventato un fondamentale strumento di studio per sistemi biologici, basa il suo principio di funzionamento sulla misura di forze interatomiche tra una sonda appuntita, localizzata all’estremità di una leva elastica (cantilever), ed il campione. Gli effetti di tali forze causano la flessione della leva, che viene monitorata attraverso un sistema ottico rilevando la riflessione di un raggio laser che è fatto incidere sul dorso della leva e riflesso verso un detector a quattro quadranti che ne legge gli spostamenti laterali e verticali, permettendo la ricostruzione della topografia del campione. La capacità dell’AFM di misurare forze intra- ed intermolecolari con una sensibilità del picoNewton, consente di impiegare questa tecnica per applicazioni molto sofisticate, quali la spettroscopia di forza atomica (AFS) che prevede l’utilizzo del cantilever come sonda per la misura di interazioni molecolari. Questo consente di seguire processi di riconoscimento tra partner biologici e di estrarne le proprietà cinetiche e termodinamiche, fornendo inoltre una misura della forza di legame tra le molecole; riprodurre e misurare fenomeni quali lo stretching di polimeri o molecole biologiche,
come proteine e materiale genetico; oppure sondare le proprietà nanomeccaniche di campioni quali virus, cellule o batteri e monitorarne cambiamenti morfologici indotti da trattamento con farmaci o da esposizione ad agenti inquinanti.
La relativa semplicità del principio di funzionamento dell’AFM e l’enorme versatilità come approccio analitico, hanno fatto sì che venisse adoperato per l’ottenimento di obbiettivi più ambiziosi in nanotecnologia, come la progettazione e la costruzione di microdispositivi per applicazioni in campo sensoristico, e sicuramente per il conseguimento di nuove conoscenze in campo biomedico, diagnostico e del monitoraggio ambientale. In questo contesto è stato incentrato l’argomento di ricerca di questa tesi, nella quale complessi sistemi biologici di notevole interesse ambientale, biomedico e nanotecnologico, sono stati oggetto di approfondite indagini sulla nanoscala attraverso le quali proprietà chimico-fisiche con notevoli potenzialità applicative sono state analizzate e presentate. In particolare, sono stati condotti studi dettagliati riguardanti la famiglia di proteine del p53, direttamente coinvolte nel mantenimento dell’integrità del genoma umano e quindi nella repressione di tumori. Infatti, il p53, descritto come “guardiano del genoma”, è stato identificato essere membro di una famiglia di fattori di trascrizione coinvolti nei processi di regolazione del ciclo cellulare e quindi proliferazione, morte ed apoptosi. I tre membri di questa famiglia, p53, p63 e p73, condividono una struttura molecolare molto simile e gran parte delle loro funzioni fisiologiche ed antitumorali. Questa elevata omologia strutturale ma soprattutto funzionale, sembrerebbe essere cruciale in condizioni tumorali, poiché più del 50% dei tumori umani sono caratterizzati dalla presenza di forme mutate e mal funzionanti di p53. In queste cellule aberranti, l’attività anticancro di p53 può essere attuata da p63 e p73, i quali possono quindi essere identificati come target ideali per terapie anticancro in tessuti tumorali caratterizzati da forme inattive o degenerate di p53. Su queste basi, è stato condotto uno studio nanotecnologico riguardante l’interazione tra p63 e p73 con un peptide antitumorigenico, p28, già noto per la sua attività anticancro dovuta alla sua capacità di interagire con p53 ed aumentarne i livelli intracellulari attraverso l’inibizione dei processi di degradazione. Quindi, le interazioni tra p28/p63, e p28/p73 sono state l’oggetto di uno studio in cui misure di AFS sono state combinate ad approcci immunologici e computazionali per poter fornire un’analisi molto dettagliata della cinetica e dell’affinità di questo legame. I risultati hanno rivelato che p28 è in grado di interagire con entrambe le proteine in modo stabile e specifico, alterandone l’espressione in modo indipendente dall’inibizione del legame con le ligasi E3, principali responsabili della degradazione di p53.
Inoltre, questa superfamiglia di proteine è stata al centro di un secondo studio cinetico nel quale l’interazione tra una forma mutata di p53 (R175H) e la proteina p73 è stata investigata a livello nanoscopico. Il processo di riconoscimento tra queste due proteine riveste infatti particolare
interesse in ambito biomedico e farmacologico in quanto è stato riscontrato che in cellule tumorali, forme mutate di p53 possono sequestrare ed inattivare p73, riducendone l’attività pre-apoptotica e rendendo le cellule resistenti alle chemioterapie e quindi più aggressive. Questo complesso si dimostra essere un target ideale per innovative strategie farmacologiche antitumorali e per la progettazione di nuovi farmaci specifici per cellule cancerose portanti forme mutate di p53. La cinetica dell’interazione è stata quindi studiata combinando misure di AFS condotte sulla singola coppia di proteine con esperimenti in condizioni di bulk tramite risonanza plasmonica di superficie (SPR). I parametri cinetici estratti hanno rivelato che p73 e p53R175H interagiscono formando un complesso stabile con alta affinità, mentre nessuna interazione è risultata tra forme wild type di p53 e p73.
L’elevata versatilità dell’AFM è stata inoltre impiegata per l’analisi delle proprietà nanomeccaniche di nanoparticelle derivate dal virus vegetale Tomato Bushy Stunt virus (TBSV), il quale risulta essere un sistema particolarmente attraente per le sue potenzialità applicative come nuovo nanomateriale in biomedicina e nanotecnologia, date le dimensioni e la forma molto regolare delle sue particelle, semplici da produrre in vitro ed estremamente adattabili a condizioni ambientali diverse. La caratteristica più interessante di questo virus è la capacità di modificare la sua struttura esterna in seguito a variazioni di pH e concentrazioni di ioni calcio e di aprire dei pori sulla sua superficie, rendendo accessibile la porzione interna. Questo processo sembrerebbe verificarsi durante i primi stadi del ciclo infettivo. È stata dunque condotta un’indagine nanoscopica nella quale sono stati valutati gli effetti che pH e concentrazioni di ioni calcio potessero avere sulla meccanica di queste particelle virali tramite misure di nanoindentazione basate sull’utilizzo dell’AFM. Le particelle di TBSV si sono rivelate essere molto resistenti e stabili in risposta a stress fisici (indentazioni della sonda AFM in condizioni fisiologiche) e chimici (deplezione di ioni calcio e variazioni di pH), dimostrandosi quindi essere particolarmente adatte come nanocarrier.
Negli ultimi anni, le tecniche SPM hanno guadagnato un’importanza crescente nel campo della progettazione e sviluppo di dispositivi sensoristici ultrasensibili, data la loro capacità di misurare singole interazioni molecolari, ricostruire la morfologia di superfici, sondandone le proprietà elettriche, chimiche e ottiche. In questo contesto, abbiamo condotto un accurato studio riguardante un sistema antigene-anticorpo utilizzabile per lo sviluppo di biosensori applicabili in campo diagnostico e terapeutico. Il processo di formazione del complesso tra la β2-microglobulina e il suo anticorpo monoclonale è stato studiato seguendo l’interazione su supporto solido tramite AFM, visualizzando le due proteine interagenti ed identificando le più ricorrenti geometrie di legame, determinando inoltre la forza dell’interazione e i parametri cinetici tramite AFS e SPR. La combinazione di questi avanzati approcci analitici ha permesso di caratterizzare estensivamente il
processo di bioriconoscimento tra queste due proteine interagenti su di un supporto solido, fornendo importanti informazioni per l’ottimizzazione ed il disegno di piattaforme biosensoristiche.
Alla luce dei risultati ottenuti in questa tesi è possibile evincere l’elevata versatilità ed il potenziale analitico delle nanotecnologie SPM, che incoraggiano future innovazioni e progressi in campi scientifici diversi, portando verso l’ottimizzazione e sviluppo di innovative ed efficaci strategie diagnostiche, trattamenti terapeutici mirati e sistemi di monitoraggio ambientale, evidenziando inoltre la stretta connessione tra stress ambientali e rischi per la salute umana.
Dottorato di ricerca in Scienze Ambientali
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