Evaluation of biochemical effects of oxidative stress in blood bank-stored red blood cells

Abstract

Blood banking underpins modern medical care, but blood storage, necessary for testing and inventory management, reduces the safety and efficacy of individual units of red blood cells (RBCs). Stored RBCs are damaged by the accumulation of their own waste products, by enzymatic and oxidative injury. These chemical activities lead to a complex RBC storage lesion that includes haemolysis, reduced in vivo recovery, energy and membrane loss, altered oxygen release, reduced adenosine triphosphate and nitric oxide secretion, and shedding of toxic products. The latter includes also free iron that can potentiate susceptibility to oxidative stress, which in turn promotes oxidative-lesions to proteins, lipids (peroxidation) and morphological changes (membrane blebbing, vesiculation). In particular, reactive oxygen species seem to be the eligible trigger for these lesions and the main contributor to the final quality loss (both at the macroscopic and microscopic levels) of RBCs. In order to ensure safety and quality of blood products, the study of in vitro (storage conditions) ageing of red blood cell has recently taken advantage of the introduction of mass spectrometry-based “omics” disciplines, such as proteomics, metabolomics and lipidomics, which are characterized by the systematic determination and quantification of broad classes of molecules, such as proteins, metabolites and lipids. Data from multiple “omics” platforms can be then integrated through bioinformatic approaches and mathematical modeling to obtain a system biology level of understanding, which has been performed during our research. During this work of thesis, we focused on the evaluation of irreparably protein oxidative modifications, in particular those related to non-enzymatic glycosylation of hemoglobin α and β-chains (HbA1c). The observation of apparently increased rates of HbA1c levels over storage progression might be also exacerbated by the excessive glucose found in anticoagulant and additive solutions. On the contrary, we followed how some of these oxidation products can be repaired (e.g. oxidations of sulfur-containing amino acid residues), representing an exceptional way to sense the redox state in cells. The glycolytic enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) has been found to regulate its activity in response to storage-induced oxidative stress through the formation of an intramolecular disulfide bond involving catalytic cysteines. This mechanism has been postulated to function as a metabolic switch to redirect carbohydrate flux from glycolysis to the pentose phosphate shunt, allowing the red cell to maintain oxidation-reduction balance and protect itself against oxidative insults. Hereby, we describe alternative storage protocols which have been proposed in order to overpass these hurdles, such as RBC anaerobic storage. We could confirm previous evidences about long term anaerobiosis promoting glycolytic metabolism in RBCs and prolonging the conservation of high energy phosphate reservoirs and purine homeostasis. In parallel, we evidenced that, contrarily to aerobic storage, anaerobiosis impairs erythrocyte capacity to cope with oxidative stress by blocking metabolic divertion towards the pentose phosphate pathway, which negatively affects glutathione homeostasis. Therefore, although oxidative stress was less sustained than in aerobically stored counterparts, its markers still accumulate over anaerobic storage progression. Finally, we presented an HPLC-microTOF-Q approach to investigate the RBC lipidome. We could exploit this analytical workflow to consolidate existing knowledge on the RBC lipid composition and individuate statistically significant fluctuations of lipids throughout storage duration of RBC concentrates under blood bank conditions. While this field of research still warrants future investigations, our analysis indicated ceramides, glycerophospholipids and sterols as key targets of RBC storage lesions to the lipidome, which will deserve further targeted investigations in the future

L'ampia utilizzazione terapeutica del sangue umano rende indispensabile garantire la qualità e la sicurezza del sangue e dei suoi componenti, nonché la loro conservazione, quando gli stessi siano destinati alla trasfusione. I metodi di conservazione attualmente in uso mantengono la vitalità della maggior parte degli eritrociti, uno degli emocomponenti ad oggi maggiormente utilizzati, per le prime due settimane. Al limite della scadenza (42 giorni), una notevole percentuale di eritrociti non è più vitale e oltre il 30% di essi viene eliminato dal sistema immune del ricevente. In particolare, le emazie concentrate leucodeplete, conservate per lunghi periodi (eritrociti "vecchi") differiscono, morfologicamente e funzionalmente, da quelli conservati per periodi più brevi. Con la definizione “lesioni da conservazione” si intende un insieme di modificazioni cellulari, metaboliche e biochimiche alle quali vanno incontro gli eritrociti durante la conservazione e che possono potenzialmente condurre a danni irreversibili. Le modificazioni cellulari comprendono deplezione di ATP (adenosin-trifosfato) e di 2,3DPG (2,3-difosfoglicerato), e comparsa di vescicole e di lipidi per fenomeni di ossidazione, con perdita di deformabilità. La diminuzione di ATP rende le emazie meno flessibili, diminuisce la loro capacità di transitare nel microcircolo e, perciò, di apportare O2. Nella maggior parte degli eritrociti conservati, avanti il termine della prima settimana di conservazione, viene perduta una gran quantità di 2,3-DPG, che scompare quasi completamente dopo due settimane. La curva di dissociazione dell'O2 vira a sinistra, diminuendo così la capacità degli eritrociti di apportare ossigeno ai tessuti periferici. Trasfondere emazie vecchie significa non solo trasfondere emazie con limitate capacità di deformarsi e di apportare O2 ai tessuti, ma anche prodotti considerati “tossici”, quali l’heme libero che si accumula in seguito all’aumento del processo di emolisi e che va a potenziare la suscettibilità eritrocitaria allo stress ossidativo, con danni su proteine, metaboliti e lipidi. Al fine di migliorare la sicurezza e la bontà della terapia trasfusionale, gli studi di conservazione in vitro delle emazie concentrate sono stati supportati dall’avvento delle cosiddette scienze “omiche”, quali proteomica, metabolomica e lipidomica, la cui determinazione sistematica di un’ampia classe di molecole, di cui sopra, ha permesso di integrare gli approcci bioinformatici e modelli matematici, per una migliore conoscenza. Il lavoro di tesi è volto proprio alla valutazione degli effetti biochimici dello stress ossidativo su proteine, metaboliti e lipidi. Ci siamo focalizzati, in primo luogo, sullo studio dell’evento del fenomeno della glicosilazione non-enzimatica delle catene α- e β- dell’emoglobina (HbA1c). L’osservazione dei livelli apparentemente aumentati di HbA1c durante la progressione del periodo di conservazione potrebbe essere esacerbato dalle elevate concentrazioni di glucosio che gli eritrociti devono fronteggiare, per la presenza di soluzioni additive. Al contrario, è stato possibile osservare come alcuni prodotti di ossidazione possano essere riparati (per esempio, l’ossidazione dei gruppi solfurici dei residui amminoacidici), rappresentando un’eccezione rispetto al modo di percepire lo stato redox nell’eritrocita. Abbiamo seguito, infatti, la regolazione dell’attività dell’enzima Gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) in risposta allo stress ossidativo, con formazione di un ponte disolfuro intramolecolare che coinvolge i residui amminoacidici di Cisteina del sito attivo catalitico dell’enzima. È stato postulato che questo meccanismo possa funzionare da switch metabolico per reindirizzare il flusso dei carboidrati dalla glicolisi allo shunt dei Pentoso Fosfato, permettendo alla cellula di mantenere l’equilibrio ossido-riduttivo e proteggersi dai danni ossidativi. Per tale ragione, abbiamo deciso di seguire strategie di conservazione alternative, quali la completa eliminazione dell’ossigeno dalle sacche di sangue ad uso trasfusionale. È stato possibile confermare ciò che era già noto in letteratura, ovvero che l’anaerobiosi promuove il metabolismo glicolitico e permette una conservazione più duratura delle riserve di fosfati ad alta energia e dell’omeostasi delle purine. In parallelo, è stato possibile evidenziare che, a differenza di quanto avviene in condizioni di conservazione standard, l’anaerobiosi impedisce l’eritrocita di fronteggiare lo stress ossidativo, bloccando la sua diversione metabolica verso il pathway dei Pentoso Fosfato, e regolando negativamente l’omeostasi del glutatione. Infatti, sebbene lo stress ossidativo sia meno sostenuto rispetto alla sua controparte aerobica, i suoi marker si accumulano progressivamente. Infine, sarà presentato un approccio analitico HPLC-microTOF-Q di indagine del lipidoma eritrocitario. I dati sono solo preliminari e sono volti a consolidare le conoscenze esistenti sulla composizione lipidica eritrocitaria e ad identificare le fluttuazioni statisticamente significative dei lipidi delle emazie durante il loro periodo di conservazione. Sebbene questo campo di ricerca necessiti una notevole implementazione futura, allo stato dell’arte la nostra analisi indica le ceramidi, i glicerofosfolipidi e gli steroli come possibili target delle lesioni da conservazione.