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Title: Il priming come meccanismo di difesa di Oryza sativa spp. Japonica: analisi genetiche ed epigenetiche
Other Titles: Priming as defense mechanism in Oryza sativa spp. Japonica: genetics and epigenetics analysis
Authors: Sabatini, Benedetta
Keywords: Priming;Oryza sativa;Immunità;Espressione genica;Epigenetica;Immunity;Gene expression;Epigenetic;BIO/10
Issue Date: 8-May-2015
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 27. ciclo
Abstract: 
Nel loro habitat le piante devono far fronte a vari stress di natura biotica ed abiotica, quindi hanno
evoluto vari meccanismi di difesa per la loro sopravvivenza. Le molecole associate al patogeno o
PAMP vengono riconosciute da proteine recettrici della cellula vegetale innescando un pathway di
segnalazione che culmina con l'espressione dei geni di difesa. Questa è chiamata immunità
stimolata dai PAMP o PTI. Tuttavia il patogeno ha evoluto la capacità di sintetizzare delle molecole
effettrici che, aggirando la PTI, rendono la pianta suscettibile alla malattia. Però anche la pianta ha
evoluto la capacità di sintetizzare delle proteine di resistenza che riconoscono e legano le molecole
effettrici del patogeno innescando l'immunità stimolata dall'effettore o ETI. Oltre a questi
meccanismi di difesa, le piante possono anche trovarsi in una condizione fisiologica in cui si attua
uno stato chiamato priming o sensitizzazione in cui la pianta si prepara a rispondere allo stress.
Questa condizione si innesca in seguito ad un trattamento della pianta con un agente che se ad alte
dosi indurrebbe lo stress, invece a basse concentrazioni semplicemente risveglia il sistema di difesa
vegetale. Quindi, piante primed risultano essere più reattive al successivo stress rispetto a quelle
non-primed. Tutto ciò è possibile in quanto il trattamento a basse dosi induce vari effetti tra cui l'
accumulo dei trascritti, l'attivazione dei fattori di trascrizione, l'attivazione della cascata delle
MAPK, dei cambiamenti metabolici e non ultimi dei cambiamenti epigenetici.
Nella prima parte di questa tesi è stato indotto il priming nella monocotiledone modello Oryza
sativa, di cui è noto il genoma, utilizzando un fitormone coinvolto in un pathway di difesa a stress
biotici: l'acido salicilico (SA). I risultati di RT-PCR semiquantitative su coleoptili di riso hanno fatto
emergere che alcuni geni mostravano effetti benefici in seguito al pretrattatmento del SA a basse
dosi (100μM) in quanto venivano espressi a livelli molto più elevati in seguito ad infezione con il
patogeno fungino Fusarium culmorum, rispetto ai coleoptili solo infettati. Tali geni sono: CEBIP,
CHITINASI, WRKY71, NH1, BISAMT.
Nella seconda parte di questa tesi è stato indotto il priming utilizzando il derivato di un altro
fitormone coinvolto nella risposta a stress abiotici, il Metil-Jasmonato (Me-JA), il quale è un
derivato dell'acido jasmonico (JA). Piante di riso di 4 settimane cresciute in idroponica sono state
pretrattate con J (10μM) e successivamente ferite. Alcuni geni coinvolti nel pathway di
segnalazione del JA hanno mostrato una maggior espressione nei campioni pretrattati e poi feriti,
rispetto ai campioni solo feriti. I geni che seguivano tale andamento sono BBPI e POX.
In un secondo momento l'attenzione è stata posta sulle modifiche epigenetiche che possono essere
alla base di tale meccanismo, perciò sono state condotte della analisi di Methylation Specific PCR
(MSP) in precise zone del promotore di BBPI e POX per investigare la presenza della metilazione a
carico delle citosine del DNA (5'- metilcitosina). Tale analisi non ha fatto emergere alcuna
correlazione tra espressione genica e metilazione del DNA per le zone analizzate. Successivamente
è stata eseguita un'analisi di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per studiare le modifiche
istoniche nelle zone da -2000 bp a +500bp per entrambi i geni, focalizzando l'attenzione
sull'acetilazione della lisina 9 dell'istone H3 e sulla trimetilazione della lisina 4 dell'istone H3,
entrambe associate ad uno stato genico di espressione. Tali analisi hanno evidenziato una maggiore
presenza dell'acetilazione della lisina 9 dell'istone H3 rispetto alla trimetilazione anche se risulta
evidente che entrambe siano correlate positivamente con l'espressione di tali geni.

In their habitat plants have to cope with different kind of stress: biotic and abiotic. To survive they
evolved several defense mechanisms based on the recognition of pathogen-associated molecules
(PAMP) using receptor proteins. Thus a defense pathway is activated to induce defense gene
expression. This immunity is called immunity triggered by PAMP (PTI). But pathogens have
evolved the ability to produce effector molecules to induce disease, avoiding the activation of PTI.
These effector molecules are recognized by plant resistance proteins to induce the immunity
triggered by effector (ETI).
Moreover plants can be in a physiological state that render them more reactive to stress, namely the
priming state. This condition is induced after a pre-exposure to low doses of stress inducing
molecules which induce a partial activation of immunity system to make the defense response of
primed plants stronger and faster than non primed ones.
Here, we investigated priming induction in Oryza sativa spp. Japonica, a model monocot, using
salycilic acid (SA), which has a pivotal role in responses against biotic stress. So we used
semiquantitative RT-PCR to analyze expression levels in coleoptiles of SA-responsive genes under
4 different condition: control plants (treated with water), plants treated with SA (100μM), plants
infected with Fusarium culmorum spores and plants infected after SA treatment. Some genes
showed higher expression levels in coleoptiles pre-treated using SA and then infected than
coleoptiles only infected. So primed-genes were: CEBIP, BISAMT, CHITINASI, NH1, WRKY71.
In the second part we induced priming in rice using a derivative of fatty acid Jasmonic Acid (JA)
with a pivotal role in defense after abiotic stress, the methyl-jasmonate coupled with wound stress.
We analyzed leaves samples from 4 leaves-stage plants using q-PCR and we investigated the
expression of wound-induced genes. Some of them showed higher expression in samples pretreated
with methyl-jasmonate (10μM) and wounded than in wounded only. So, primed-genes were:
BBPI and POX. Then we focused our attention on epigenetic changes correlated with priming
phenomenon: DNA methylation and histone modifications.
We investigated DNA methylation in two distinct regions of the promoters of BBPI and POX using
Methylation Specific PCR (MSP) approach. The result did not highlight a positive correlation
between DNA methylation and gene expression. Then we analyzed histone modifications in a
region from -2000bp to +500bp of both genes using antibodies against acetylation of lysine 9 of
histone H3 (acK9H3) and three-methylation of lysine 4 of histone H3 (3metK4H3) with a
Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) assay. The result revealed that acetylation is more frequent
than methylation but anyway there is a positive correlation between these modifications and gene
expression.
Description: 
Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare
URI: http://hdl.handle.net/2067/2920
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