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Title: Studio della biodiversità batterica in acqua marina e rocce del continente Antartide
Other Titles: Study of the bacterial biodiversity of sea water and rock samples from Antarctica
Authors: Silvi, Silvia
Keywords: Biodiversità;Batteri;Tecniche colturali;Tecniche fingerprinting;Biodiversity;Bacteria;Coltural techniques;Fingerprinting techniques;BIO/19
Issue Date: 26-Jun-2015
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 27. ciclo
According to the Convention on Biological Diversity, Biodiversity is “the variability among living organisms from all sources including, inter alia, terrestrial, marine and other aquatic ecosystems, and the ecological complexes of which they are part; this includes diversity within species, between species, and of ecosystems”.
Antarctica is the coldest, driest, and windiest continent. The temperature can reach -30 °C, the precipitation is only 5-20 g/cm2/year and the highest recorded wind velocity is 327 km/h. It has the highest average elevation of all the continents, and about 98% of its surface, 14 million km2, is covered by ice. In these extreme conditions, only cold-adapted organisms survive, including plants, animals, and microorganisms. The Antarctic continent has been frequently cited as a pristine place, with a rather limited diversity of plants and animals, but with highly diverse microbial community.
In this work we studied the bacterial community obtained from sea water and rock samples collected in Antarctica. The study has been carried out both on cultivable strains, isolated by traditional methods, and on the total bacterial community by molecular methods. The isolates were investigated in order to understand their temperature and salinity preferences. Furthermore, a detailed taxonomical study was carried out both on cultivable and total bacterial population.
Study about bacterial isolates
 Strain isolation and preliminary tests
Isolates derived from two different typology samples: sea water (BA) and rock (BAR).
Sea water was sampled in various areas of Ross sea at different distances from the coast: Faraglione (300 m), Santa Maria Novella (2.5 Km), Portofino (1 Km), Thetys Bay (0 m). The rocks samples were sampled according to a longitudinal and altitudinal transect at increasing distance from the sea in 57 different places. Moreover for each sample place were considered different sites.
Rocks were fragmented and strewed on PCA plates and water was filtered on membranes in order to obtain both bacteria pure cultures and DNA for the molecular investigations. Pure cultures of the isolates were obtained by plate streak method. Preliminary tests were carried out considering strain morphological characteristics (shape, color and dimensions), Gram reaction and simple biochemical tests (catalase and oxidase production). This preliminary selection permitted to remove the majority of replicates. A total of 100 isolates were obtained.
 Taxonomical identification of the isolates
Bacterial genomic DNA was extracted from pure cultures and used for the amplification of 16S rDNA to allow taxonomical identification of each isolate. The
strains were affiliates to the genera: Microbacterium, Psychrobacter, Diezia, Marisediminicola, Bacillus, Sporosarcina, Arthrobacter, Pseudomonas, Deinococcus, Brevundimonas, Frondihabitans, Rhodococcus, Agrococcus, Auraticoccus, Kocuria.
Only 54% of the strains were identified to species level and the remaining were identified only to the genus level.
In some cases Blast analyses supplied uncertain identification, sequences were aligned with highly similar 16S in the NCBI Genbank and phylogenetic analysis was performed. Three phylogenetic trees were created for the most important and representative groups: Pseudomonas, Arthrobacter, Psychrobacter. A phylogenetic tree was constructed for all minor groups.
 Growth profiles at different Temperature and salinity
The optimal temperatures for growth of the various strains were tested in the range 0-45°C on PCA plates (steps of 5 °C).
The majority (88%) of BA strains were able to grow in a wide temperature range. The 82% of BA were psycrotolerant, 9% were mesophilic- psychrotolerant and 9% strictly psychrophilic because they had the optima at 5°C and 10°C.
All BAR strains grew in a wide temperature range. 96% of BAR were psycrotolerant and only 4% were mesophilic- psychrotolerant. The optimal salinity for growth were tested in the range 0-100 g/L on PCA plates containing different concentration of NaCl salt (steps of 5 g/L). 35% of BA strains were no halophilic, 34% were halotollerant and 31% were slightly halophilic. 65% of BAR strains were no halophilic, 26% slightly halophilic and 9% were halotollerant.
Study of total bacterial community
In order to have a complete overview of the bacterial community structure, by a cultivation-independent approach, total DNA was extracted from the filter-membranes and rocks samples. The bacteria biodiversity was studied by PCR-DGGE fingerprinting. The genetic target used was the hypervariable region V3 of the 16S rDNA. DGGE gel images allow the analysis of band patterns generated from the environmental samples representing the various species present in the community. A single species is identified by a single band and the relative abundance of a single species is determined by band intensity.
 Bacterial community in the sea water samples
DGGE analysis was conducted for the bacterial communities present in marine samples from four different sites in the Ross Sea and sampled in three different times.
To evaluate the structure of the bacterial community and perform a clustering analysis of the various DGGE profiles two software were used: Quantity One 1-D and Phoretix 1-D. Pearson and Dice dendrograms reflect the high heterogeneity of the sea samples and there was not a clear correlation between either in terms of sites, nor according to the time of sampling. Some bands were excised from the gel, re-amplified, sequenced and compared with NCBI GenBank database sequences. A phylogenetic tree was built to understand the relationships between the sequences. The comparison in the database shows that 67% of the identified sequences were close to unclassified species or uncultured bacteria.
155 bands were observed and the band intensity was calculate for all lanes (profiles) to have information on the relative abundance of species. The biodiversity and richness was estimated with 8 indices: Richness (n°), Weighted Richness (Rr), Stability index, Margalef index, Pielou’s evenness index, functional organization (Fo), Simpson and Shannon index.
The correlation of 3 environmental variables: temperature, distance from the coast, presence/absence of ice, with the structure of the microbial communities was observed by NMDS analysis (not metric Multi Dimensional Scaling).
In a two-dimensional plot the sea water samples were divided in 3 groups: α, β, γ.
The temperature seems to be positively correlated to the group γ and negatively correlated to the α and β groups. While, the variables presence/absence of ice and distance from the coast were positively correlated with the α, β groups and negatively correlated to the γ groups.
 Bacterial community in the rock samples
The endolithic bacterial community present in rocks samples collected in the McMurdo Dry Valleys of, Victoria Land, was analyzed by the PCR-DGGE technique.
The work was divided in two parts:
- A first analysis had allowed the study of the total bacterial communities present in 70 samples collected in 57 Victoria Lands sites. For same sites were present more rocks of different types.
- A second analysis allowed to investigate how the bacterial biodiversity changes in the micro and macro rock environment. Three sites were analyzed: Richard Nunatak, Vegetation Island and Mt.Howard. For each site were tested two roks samples, both individually and combined together. In addition, from one of the two rocks were derived three sub samples, identified as A, B, C.
 Total rocks samples
The structure of bacterial endolithic communities was studied by a cluster analysis with two software: Quantity One 1-D and Phoretix 1-D.
Dice and Pearson coefficients described a strong heterogeneity among the rock samples. In addition, in the dendrograms no correlation was observed between distribution of the samples and their sampling sites.
61 bands were excised from the gel, re-amplified, sequenced and compared with NCBI GenBank database sequences. The phylogenetic analysis showed that 84% of the sequences presented no similarity with the species and/or genera known.
In particular, 46% were related to sequences deposited in the data bank as “Uncultured bacterium”, 25% had similarity with sequences of know genera but a unknow species and 13% showed no similarity with deposited sequences.
The biodiversity and richness indices were calculated to describe the bacterial endolithic communities. All rock samples were characterized by high values of biodiversity and richness. The results showed that biodiversity and richness were not affected by position and type of the rock. All samples showed a high heterogeneity.
NMDS analysis was done to understand how five variables: altitude, distance from the sea, type of colonization, porosity and type of rock, influenced the biodiversity and richness of rock samples. In the two-dimensional plot each sample appeared to be influenced differently by the five variables and a common relationship was not observed.
The results described an environment in which many variables and theit combination determined the biodiversity and richness of community. Each sample is affected differently by the variables and it was not clear how the variables influenced the endolithic bacterial distribution.
 Micro and macro rock habitat
The micro habitats present inside the rock are influenced by numerous factors: position and orientation of rocks, altitude, permanence of the snow cover. These are significant aspects in the selection of the microorganisms and the position and portion in which the microrganism will begin colonization. This means that within the rock numerous micro habitats are present. These have different characteristics and will influence the development the type of the microbial community.
Using the dendrograms based on Dice and Pearson coefficient has investigated the biodiversity into the two rocks of the same site and the diversity in the sub samples, identified as A, B, C.
The bacterial endolithic communities had a great heterogeneity even if the bacterial profiles in the same sites were similar and had common bands.
The results obtained by biodiversity and richness indices for Richard Nunatak, Mt.Howard and Vegetation Island samples confirmed the results obtained other analysis. These results reinforce the hypothesis that Antarctic rock environment contains numerous micro habitats and the rock represents a complex ecosystem in which each factor causes large variations in microbial communities.
Taxonomic DGGE results obtained by the total community study were quite different from those gained by the pure cultures. This could be explained by the limits of two approaches. The first is a cultural technique that allows to study only bacteria that can grow in laboratory. The second is an cultured indipendent technique, but the DGGE can detect bacteria representing at least 1% of the total community.
It is possible that some species, present in a very low percentage and not observed in DGGE, had prevailed under to favorable culture conditions during the isolation procedures.
This work is very interesting to understand the structure of bacterial communities in sea water and rocks samples. In particular, Biodiversity and Richness in rock habitats is extremely high and the results underlined that it’is necessary to increase the knowledge so far collected and further expand the studies on bacterial communities endolithic Antarctica.

Il significato di Biodiversità, con le sue diverse accezioni, lo si può comprendere più facilmente quando non lo si considera come termine assoluto, ma come qualcosa dipendente dal contesto che si sta studiando. De Long nel 1996 afferma: “La Biodiversità è un attributo di un territorio e in particolare si riferisce alla varietà all'interno e tra organismi viventi, nell’insieme di organismi viventi, nelle comunità biotiche e nei processi biotici presenti in natura o modificati dall'uomo. La Biodiversità può essere misurata in termini di diversità genetica e con l'identità e il numero di diversi tipi di specie, insieme di specie, comunità biotiche e processi biotici, e la quantità (abbondanza, biomassa, copertura,) e la struttura. Può essere osservata e misurata in qualunque scala spaziale che va da micrositi a differenti habitat per l'intera biosfera”.
L’Antartide per posizione geografica, caratteristiche fisiche e la quasi totale assenza di perturbazioni antropiche rappresenta un ambiente estremo particolarmente interessante per la ricerca scientifica; non solo per lo studio della Biodiversità che qui si può osservare, ma anche per la ricerca dei vari processi evolutivi e i cambiamenti climatici che prendono parte al “global change”. L'Antartide è il continente più meridionale della terra, si sviluppa quasi totalmente all'interno del Circolo Polare Antartico e comprende i mari e le terre che circondano il Polo Sud. E’ il continente più freddo, più secco e ventoso. La temperatura varia da valori che si aggirano attorno a 0°C in estate sulla costa, fino a sfiorare i -90°C in inverno a 3000 metri di quota. Le precipitazioni sono piuttosto scarse e si aggirano intorno ai 5-20 g/cm2/anno. I venti possono superare i 200 km/h. Ha la più alta elevazione media se confrontato con gli altri continenti e il 98% del suo territorio è coperto dalla Calotta glaciale Antartica con uno spessore medio di 1,6 km.
Il progetto di ricerca presentato prevede lo studio delle popolazioni batteriche presenti in campioni di acqua marina e di rocce prelevate in diverse zone dell’Antartide. L’attività è stata caratterizzata da un lavoro sperimentale suddiviso in due parti fondamentali: la prima, legata ad un approccio basato su tecniche coltura-indipendenti e la seconda legata all’utilizzo di tecniche colturali. I campioni marini provenienti dal mare di Ross e i campioni di roccia sono stati raccolti durante la campagna 2010-2011 del progetto PNRA (Programma Nazionale di Ricerche in Antartide). Le acque sono state prelevate in tre periodi distinti, in 4 differenti siti a differente distanza dalla costa: Faraglione, Santa Maria Novella, Portofino e Thetys Bay, mentre le rocce sono state campionate secondo un transetto longitudinale e altitudinale a crescente distanza dal mare nelle Valli Secche di McMurdo, Terra Vittoria. Le informazioni sulle comunità batteriche delle rocce antartiche non sono numerose e poco si conosce dei generi e delle specie che è possibile osservare in questi particolari habitat. Con questo lavoro è stato possibile ampliare e approfondire le conoscenze sulla struttura delle comunità batteriche endolitiche antartiche ed inoltre, lo studio delle comunità batteriche delle acque del mare di Ross hanno permesso di confrontare le due diverse tipologie di
comunità evidenziando come alcuni generi siano presenti in entrambi gli ambienti, mentre altri siano specifici dell’uno o dell’altro habitat.
Studio dei ceppi isolati
 Isolamento e test preliminari
I ceppi isolati derivano da campioni di acqua di mare (BA) e campioni di roccia (BAR).
Le rocce erano frammentate e poste su piastre di PCA. L’acqua è stata preventivamente filtrata e le membrane poste su piastre di PCA. Le colture pure erano ottenute mediante la tecnica dello striscio. Uno screening iniziale e test preliminari, studio morfologico della cellula e della colonia e test biochimici, hanno permesso di eliminare replicati consentendo di ottenere 100 isolati.
 Identificazione tassonomica dei ceppi mediante il gene 16S rDNA
Il DNA era estratto dalle colture pure è stato usato per amplificare il gene 16S rDNA, il quale ha permesso l’identificazione tassonomica di ogni isolato.
Solo il 54% dei ceppi potevano essere identificati a livello di specie, mentre i restanti erano identificati solo al livello di genere. I ceppi erano affiliati ai generi: Microbacterium, Psychrobacter, Diezia, Marisediminicola, Bacillus, Sporosarcina, Arthrobacter, Pseudomonas, Deinococcus, Brevundimonas, Frondihabitans, Rhodococcus, Agrococcus, Auraticoccus, Kocuria. Sono stati costruiti quattro alberi filogenetici allineando le sequenze dei ceppi identificati con le sequenze presenti in banca dati NCBI GenBank con le quali si erano ottenuti i più alti valori di similarità. Gli alberi filogenetici erano costruiti per i tre generi più rappresentativi: Pseudomonas, Arthrobacter, Psychrobacter, mentre un albero era costruito per tutti i gruppi minoritari.
 Profili di crescita a differenti temperature e concentrazioni saline
Il profilo di crescita a differenti temperature per i ceppi antartici era determinato monitorando la crescita delle colonie batteriche su piastre di PCA in un intervallo di temperatura tra 0 e 45°C con step di 5°C. 88% dei ceppi BA erano in grado di crescere in un ampio intervallo di temperatura e solo il 12% arrestava la propria crescita sotto i 35°C. L’82% dei ceppi BA erano psicrotolleranti, il 9% erano mesofili-psicrotolleranti e il 9% erano psicrofili stretti, avendo un optimum a 5-10°C. Tutti i BAR crescevano in un ampio intervallo di temperatura; il 96% erano psicrotolleranti e solo il 4% erano mesofili-psicrotolleranti. L’optimum e il range di crescita a differenti concentrazioni saline era testato monitorando la crescita delle colonie batteriche su piastre di PCA contenenti NaCl in concetrazioni 0-100 g/L, con intervalli di 5g/L. Il 35% dei BA erano non alofili, il 34% erano alotolleranti e il 31% erano moderatamente alofili. I ceppi
BAR erano principalmente (65%) non alofili, il 26% erano moderatamente alofili e il 9% erano alotolleranti.
Studio della comunità batterica totale
Oggi la comunità scientifica ritiene che circa il 99% dei microrganismi presenti in natura, non può essere isolato in colture pure. Quindi, per comprendere meglio la diversità microbica e il ruolo che essa ha nel mantenimento dell'ecosistema, sono necessarie ulteriori tecniche che completano e complementano l'approccio delle tecniche colturali. Le Tecniche di Fingerprinting molecolare consentono un confronto diretto del DNA di comunità microbiche provenienti da diversi campioni e sono considerate strumenti importanti per valutare rapidamente i cambiamenti della struttura delle comunità nel tempo e nello spazio.
La biodiversità batterica era studiata mediante la tecnica di fingerprinting PCR-DGGE.
Il target genico scelto era la regione ipervariabile V3 del gene 16S rDNA.
La DGGE si basata sull’elettroforesi di frammenti di DNA su un gel di poliacrilammide contenente un gradiente crescente di sostanze denaturanti, urea e formammide.
 Studio della comunità batterica nei campioni di acqua marina
Mediante la tecnica DGGE è stata condotta un’analisi delle comunità batteriche presenti in campioni marini provenienti da quattro differenti siti del mare di Ross e campionati in tre differenti tempi.Per valutare la struttura della comunità batterica e condurre un’analisi di clusterizzazione dei profili dei differenti campioni sono stati usati due software di analisi d’immagine: Quantity One 1-D e Phoretix 1-D.
Sia il dendrogramma basato sul coefficiente di Dice che quello basato sul coefficiente di Pearson rispecchiano l’elevata eterogeneità che caratterizza i campioni studiati evidenziando come non ci sia una netta correlazione fra di loro, né a livello di siti, né in base ai periodi di campionamento. Per ottenere una visione più dettagliata delle specie presenti nei campioni del mare di Ross, le bande più rappresentative sono state excise dal gel di DGGE, ri-amplificate, sequenziate e confrontate con le sequenze depositate in banca dati NCBI GenBank. Inoltre è stato realizzato un albero filogenetico che descrive le relazioni fra le sequenze ottenute. Il confronto in banca dati mostra come il 67% delle sequenze identificate siano appartenenti a specie non ancora classificate o non coltivabili. Questi risultati evidenziano come le conoscenze sulla biodiversità microbica in ambienti poco conosciuti ed estremi, come l’Antartide, siano ancora molto limitate. L’analisi d’immagine elaborata con il software Quantity One 1-D ha permesso di individuare un totale di 155 bande e calcolare per tutte i profili l’intensità di ogni banda così da avere informazioni sull’abbondanza relativa delle specie. La biodiversità e la ricchezza nei diversi campioni è stata stimata attraverso l’utilizzo di otto diversi indici: Ricchezza (n°), Ricchezza ponderata (Rr), indice di Stabilità, indice di Margalef , indice di Pielou, Organizzazione funzionale (Fo), indice
di Simpson e Shannon. Inoltre, per comprendere l’effetto di tre variabili ambientali: temperatura dell’acqua durante il campionamento, presenza o assenza di ghiaccio e distanza dalla costa, sulla struttura delle comunità microbiche si è scelto di applicare agli indici calcolati sui profili di DGGE la tecnica di orientamento NMDS (Non metric Multi Dimensional Scaling), la quale ha permesso di evidenziare se e come le componenti abiotiche fossero correlate positivamente o negativamente con la ricchezza e biodiversità dei campioni. Nel grafico bi-dimensionale i campioni erano suddivisi in tre gruppi: α, β, γ. Il gruppo γ sembrava essere positivamente correlato alla temperatura diversamente dai gruppi α e β che sembravano correlati negativamente. Le variabili presenza/assenza di ghiaccio e distanza dalla costa erano correlate positivamente con α, β e negativamente con γ.
 Studio della comunità batterica nei campioni rocciosi
La comunità batterica endolitica presente nelle rocce raccolte nelle Valli Secche di McMurdo, Terra Vittoria, è stata analizzata mediante la tecnica di fingerprinting molecolare PCR-DGGE. La biodiversità batterica totale è stata studiata a due differenti livelli: una prima analisi ha permesso lo studio della comunità batterica totale presente nei campioni raccolti nelle 57 località analizzando anche rocce di differente tipologia proveniente da uno stesso sito. Una seconda analisi ha permesso di investigare se e come la biodiversità batterica cambi all’interno del micro e macro habitat roccioso. Per studiare la comunità batterica due campioni di rocce della stessa tipologia e provenienti da uno stesso sito sono stati processati mediante DGGE, sia separatamente che uniti insieme. Inoltre, da una delle due rocce sono stati ricavati tre sotto campioni, identificati come A, B, C, processati separatamente per comprendere come la biodiversità cambi all’interno del micro habitat roccioso.
 Analisi dei campioni rocciosi
Per valutare la struttura delle comunità batteriche endolitiche e realizzare un’analisi di clusterizzazione dei profili dei differenti campioni sono stati usati due software di analisi d’immagine: Quantity One 1-D e Phoretix 1-D. L’analisi di cluster si è basata sul coefficiente di correlazione di Dice e sul coefficiente di Pearson. Entrambi i coefficienti hanno evidenziato la forte eterogeneità che si ha tra i campioni rocciosi. Inoltre, non è stato possibile individuare una correlazione tra la distribuzione dei profili all’interno del dendrogramma e la tipologia di roccia e la posizione dei siti da cui i campioni provengono. L’analisi mediante DGGE dei 70 campioni rocciosi ha evidenziato profili con numerose bande e di queste 61 sono state excise dal gel, ri-amplificate e i prodotti di PCR sono stati sequenziati. Le sequenze sono state confrontate con quelle depositate in banca dati NCBI GenBank e utilizzate per l’analisi filogenetica. I risultati ottenuti hanno mostrato come l’84% delle sequenze non presentavo similitudine con specie e/o generi noti. In particolare, il 46% erano simili a sequenze depositate in banca dati come “Uncultured bacterium”, il 25% presentano
maggiore similarità con sequenze di specie non coltivabili appartenenti a generi conosciuti e il 13% non mostravano alcuna similarità con sequenze depositate e questo non permetteva l’attribuzione ad alcuna specie nota. Solo il 16% delle sequenze era riconducibile a generi e/o specie note. Mediante gli indici di biodiversità e ricchezza è stato possibile descrivere ulteriormente la struttura delle comunità batteriche endolitiche dei differenti siti. Tutte le rocce erano caratterizzate da un’elevata eterogeneità; inoltre, i risultati mostravano come la diversità e la ricchezza in specie non fosse correlata con la posizione e il sito di campionamento. Al fine di comprendere come la ricchezza e la biodiversità calcolate per le comunità batteriche che colonizzano le 70 rocce studiate possano essere correlati ad alcuni fattori, è stata utilizzata l’analisi di orientamento NMDS (Non-Metric Multidimensional Scaling). Nell’analisi multivariata le variabili prese in considerazione erano: distanza dal mare (km), altitudine (m), il tipo di colonizzazione, di porosità e il tipo di roccia.
 Analisi del micro e macro habitat roccioso
I micro habitat che si sviluppano all’interno della roccia sono influenzati da numerosi fattori come la posizione, l’esposizione, l’orientamento, l’altitudine, la permanenza della copertura nevosa. Questi sono aspetti significativi nella scelta da parte dei microrganismi della posizione e della porzione nella quale avverrà la colonizzazione. Mediante i dendrogrammi basati sul coefficiente di Dice e Pearson si è studiata la biodiversità e le relazioni esistenti di rocce campionate all’interno di uno stesso sito. Inoltre si è cercato di comprendere se e come all’interno di una stessa roccia esistano più microhabitat con una differente distribuzione della comunità batterica. I risultati ottenuti mostrano come la struttura delle comunità batteriche sia caratteristica per ogni sito e come all’interno di ognuno e dei sottogruppi A, B, C non ci siano differenze rilevanti che fanno sì che i loro profili possano clusterizzare in posizioni differenti dal gruppo a cui appartengono. Mediante il software Quantity-one è stato possibile elaborare per ogni sito il confrontato tra i profili permettendo di indicare le bande comuni a tutti e quelle presenti solo in alcuni. I risultati ottenuti sembrerebbero descrivere la roccia antartica come un ambiente caratterizzato da numerosi micro habitat all’interno dei quali si sviluppano numerose comunità batteriche particolari. Quindi le estreme condizioni che caratterizzano il continente Antartide fanno si che anche piccole differenze nell’esposizione e nell’inclinazione della roccia definiscano se e come la roccia venga colonizzata. Gli indici di biodiversità e ricchezza calcolati per i siti Richard Nunatak, Mt.Howard e Vegetation Island evidenziano dei campioni caratterizzati da un elevata diversità confermando i risultati ottenuti dall’analisi del confronto dei profili di uno stesso sito. Grazie a questo lavoro di tesi è stato possibile ampliare le informazioni sulle comunità batteriche endolitiche antartiche. Le informazioni su queste comunità non sono particolarmente abbondanti, quindi la possibilità di introdurre nuove informazioni è estremamente importante per capire sia come la vita si sviluppi in ambienti estremi come l’Antaertide sia quale siano i limiti a cui gli organismi viventi sono in grado di spingersi.
Dottorato di ricerca in Ecologia e gestione delle risorse biologiche
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