Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2911
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dc.contributor.advisorPetruccioli, Maurizio-
dc.contributor.authorStella, Tatiana-
dc.date.accessioned2016-08-30T13:40:22Z-
dc.date.available2016-08-30T13:40:22Z-
dc.date.issued2014-06-05-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/2067/2911-
dc.descriptionDottorato di ricerca in Scienze ambientaliit
dc.description.abstractThe remediation of persistent chlorinated aromatic compounds has become a priority of great relevance due to the teratogenic, carcinogenic and endocrine-disrupting properties of these xenobiotics. The use of biological methodologies for the clean-up of contaminated sites, collectively referred to as “bioremediation”, has been gaining an increasing interest in recent years because it represents an effective, cost-competitive and environmentally friendly alternative to the physico-chemical and thermal treatments. In this respect, “white rot” fungi, an ecological subgroup of filamentous fungi, display features that make them excellent candidates to design an effective remediation technology (“mycoremediation”). In spite of this, fungi have not been widely exploited for their metabolic capabilities and the mechanism by which they are able to degrade the aforementioned pollutants has not been fully elucidated yet. Within this frame, the present Ph.D thesis was aimed at: i) assessing the efficiency of different mycoremediation strategies for the clean-up of a polychlorinated biphenyl (PCBs)-contaminated soil; ii) understanding the fungal degradation pathways of polychlorinated biphenyls and their major metabolites, namely chlorobenzoic acids (CBAs) and hydroxylated polychlorinated biphenyls (OHPCBs). i) The combination of chemical, toxicological and molecular biology techniques provided a comprehensive evaluatation of the technical feasibility of selected remedial strategies. Physicochemical properties (pH, soil texture, soil organic matter content, ect.) as well as the pollutant bioavailability of three different PCB-contaminated soil samples from a dumpsite (bulk soil, topsoil and rhizosphere soil) were assessed before undergoing both bioaugmentation (either with the white rot fungus Pleurotus ostreatus or Irpex lacteus) and biostimulation (addition of a lignocellulosic substrate) treatment. The inoculation of P. ostreatus in the rhizosphere soil was the most effective treatment in terms of PCB degradation and detoxification. The involvement of both intracellular and extracellular fungal enzymes in the biotransformation of PCBs was demonstrated by the identification of several PCB degradation intermediates (i.e. chlorobenzoates, chlorobenzaldehydes, chlorocresols, hydroxylated and methoxylated PCBs). Furthermore, new insights into the microbial community structure, diversity and dynamics throughout the bioremediation processes were gained with the combination of two culture-indipendent techniques: phospholipid fatty acids (PLFA) and 454-pyrosequencing analyses. PLFA analysis showed that either the introduction of allochthonous fungi or the addition of non-inoculated lignocellulosic substrate stimulated the growth of the resident bacterial populations, while the highest fungal concentration was achieved in P. ostreatustopsoil microcosms in the incubation middle phase. Metagenomic analysis of bacterial community revealed that Firmicutes relative abundance increased in Pleurotus ostreatus-bulk and -rhizosphere soil microcosms; on the other hand, in I.lacteus-augmented microcosms, an initial increase of Proteobacteria was observed whereas Bacteroidetes became dominant at the end of incubation. Analysing the fungal community structure in bioaugmented soils, P.ostreatus showed a higher ability than I. lacteus to compete with the autochthonous soil mycobiota. Indeed, P.ostreatus sequences accounted to more than 90% of the total fungal amplicons along the whole incubation period, thus proving the outstanding capability of this fungus to efficiently grow in PCBcontaminated soils under non-sterile conditions. By contrast, the large majority of fungal sequences in biostimulated microcosms belonged to the phyla Ascomycota and Zygomycota, with the exception of the topsoil where members of the phylum Basidiomycota became predominant in the later phase of the incubation ii) Microsomal fractions rich in cytochrome P450 monooxygenase (CYP450) activities were isolated from the white rot fungi Lentinus tigrinus and Pleurotus ostreatus to evaluate their involvement in the biotransformation of CBAs and PCBs, respectively. In both cases, CYP450 was firstly detected by carbon monoxide-binding spectrum, and then used to perform in vitro degradation tests with selected compounds. Such intracellular enzymatic system was able to degrade either a mixture of CBAs (L. tigrinus) or PCBs (P. ostreatus). Specifically, the identification of a hydroxylated CBA confirmed the pivotal role of CYP450 in the initial transformation of CBAs. Moreover, a semi-purified laccase obtained from P. ostreatus was capable of degrading mono- and dichlorinated hydroxylated biphenyls, at different extent, either under mediated or non-mediated conditions. The chemical structure of chlorinated organic pollutants, namely the number and position of substituents, was the main factor affecting the extent of degradation by both fungal intracellular and extracellular enzymes.en
dc.description.abstractIl risanamento di matrici ambientali contaminate da composti organoclorurati recalcitranti è divenuto una questione di fondamentale importanza a causa delle proprietà teratogeniche e cancerogene di tali composti, nonchè per le loro caratteristiche di interferenti endocrini. A tal proposito, le tecniche di risanamento biologico (biorisanamento) stanno riscuotendo un crescente interesse negli ultimi anni rispetto ai più convenzionali metodi chimico-fisici in virtù della loro comprovata sostenibilità ambientale ed economica. In particolare, i “funghi del marciume bianco”, un sottogruppo ecologico dei funghi filamentosi specializzato nella degradazione della lignina, presentano delle caratteristiche interessanti, tali da renderli degli ottimi candidati per la messa a punto di tecniche di biorisanamento (micorisanamento). Tuttavia, le straordinarie capacità metaboliche di questi funghi non sono ancora state sfruttate appieno per fini di recupero ambientale ed i meccanismi attraverso i quali essi degradano i suddetti contaminanti clorurati non sono stati chiariti in dettaglio. Detto questo, la presente tesi di dottorato ha avuto come scopo: i) la valutazione dell’efficacia di diverse tecniche di micorisanamento nel trattamento di suoli contaminati da policlorobifenili (PCB); ii) l’analisi dei meccanismi attraverso i quali i funghi del marciume bianco degradano (PCB) ed i loro principali metaboliti, acidi clorobenzoici (CBA) e policlorobifenili idrossilati (OH-PCB). i) La fattibilità tecnica delle strategie di risanamento oggetto di studio è stata valutata mediante una combinazione di analisi chimiche, tossicologiche e biomolecolari. In una fase preliminare alle prove di risanamento sono state esaminate le proprietà chimico-fisiche (pH, tessitura, sostanza organica ecc.) di tre diversi campioni di suolo (suolo non di rizosfera, suolo superficiale e suolo di rizosfera) provenienti da un sito di stoccaggio ed inoltre, è stata determinata la biodisponibilità dei contaminanti in essi contenuti. Successivamente, tali matrici sono state sottoposte sia a trattamenti di bioaumento fungino (con Pleurotus ostreatus o Irpex lacteus, due noti agenti della carie bianca del legno) che di biostimolazione (attraverso l’aggiunta di ammendanti lignocellulosici). L’apporto di P. ostreatus nel suolo di rizosfera è risultato il trattamento più efficace in termini di rimozione dei PCB e detossificazione. In generale, l’identificazione di diversi prodotti di degradazione dei PCB (acidi clorobenzoici, clorobenzaldeidi, cresoli clorurati, idrossi- e metossi-PCB) ha dimostrato il coinvolgimento di diversi sistemi enzimatici fungini, intracellulari ed extracellulari, nella biotrasformazione dei suddetti composti. Inoltre, l’utilizzo di due approcci coltura-indipendenti, ovvero l’analisi degli acidi grassi di membrana (PLFA) ed il pirosequenziamento (sequenziamento 454), ha permesso di ottenere informazioni circa la struttura e l’evoluzione delle comunità microbiche durante le prove di risanamento. L’analisi PLFA ha mostrato che l’aggiunta di inoculi fungini o di semplice substrato lignocellulosico ha avuto un effetto stimolante sulla crescita della popolazione batterica del suolo e che la più alta densità fungina è stata riscontrata nel suolo superficiale bioaumentato con P. ostreatus a metà del periodo di incubazione stabilito. L’analisi della comunità batterica effettuata tramite metagenomica ha rivelato che il bioaumento di P. ostreatus sia nel suolo non di rizosfera che di rizosfera ha indotto un aumento dell’abbondanza relativa del phylum Firmicutes, mentre nei microcosmi inoculati con I. lacteus, i phyla dominanti erano Proteobacteria e Bacteroidetes, rispettivamente nelle fasi iniziali e finali del trattamento. Dall’analisi della comunità fungina, P. ostreatus è risultato migliore di I. lacteus nel competere con la microflora autoctona dei suoli. In particolare, P. ostreatus ha rappresentato, per l’intero periodo d’incubazione, oltre il 90% delle sequenze fungine nei tre i suoli in cui è stato introdotto, dimostrando di saper crescere in suoli contaminati da PCB in condizioni di non sterilità. Di contro, nei suoli biostimolati l’aggiunta di ammendante in forma sterile ha favorito la crescita di funghi appartenenti ai phyla Ascomycota e Zygomycota, con la sola eccezione del suolo superficiale in cui il phylum Basidiomycota è diventato predominante nella seconda metà del trattamento. ii) Al fine di valutare il coinvolgimento del sistema enzimatico citocromo P450 monossigenasi (CYP450) nella degradazione di CBA e PCB, frazioni microsomali ricche di attività CYP450 sono state isolate dai funghi Lentinus tigrinus e Pleurotus ostreatus. L’attività del CYP450 è stata quantificata spettrofotometricamente al fine di effettuare successivamente delle prove di degradazione in vitro con i composti selezionati. Tale sistema enzimatico intracellulare è stato capace di degradare sia una miscela di CBA (L. tigrinus) che di PCB (P. ostreatus). In particolare, l’identificazione di una forma idrossilata di un acido clorobenzoico ha confermato il diretto coinvolgimento del CYP450 nelle fasi iniziali di trasformazione dei CBA. Inoltre, la degradazione di forme idrossilate di bifenili mono- e di-clorurati da parte di una laccasi semipurificata, estratta da P. ostreatus, è stata dimostrata sia in presenza che in assenza di uno specifico mediatore. La struttura chimica dei suddetti contaminanti ha rappresentato il principale fattore determinante le capacità degradative degli enzimi fungini sia intracellulari che extracellulari.it
dc.language.isoen-
dc.publisherUniversità degli studi della Tuscia - Viterboit
dc.relation.ispartofseriesTesi di dottorato di ricerca. 26. ciclo-
dc.subject“White rot” fungi, mycoremediationen
dc.subjectPolychlorinated biphenylsen
dc.subjectLigninolytic enzymesen
dc.subjectCytochrome P450 monooxygenases systemen
dc.subject454-pyrosequencinge
dc.subjectFunghi del marciume biancoit
dc.subjectMicorisanamentoit
dc.subjectBifenili policlorurati ligninoliticiit
dc.subjectCitocromo P450 monossigenasiit
dc.subject454-Pirosequenziamentoit
dc.titleBioremediation of persistent aromatic pollutantsen
dc.title.alternativeBiorisanamento di contaminanti aromatici persistentiit
dc.typeDoctoral Thesise
item.fulltextWith Fulltext-
item.openairetypeDoctoral Thesis-
item.cerifentitytypePublications-
item.grantfulltextopen-
item.languageiso639-1en-
item.openairecristypehttp://purl.org/coar/resource_type/c_18cf-
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