Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2911
Title: Bioremediation of persistent aromatic pollutants
Other Titles: Biorisanamento di contaminanti aromatici persistenti
Authors: Stella, Tatiana
Keywords: “White rot” fungi, mycoremediation;Polychlorinated biphenyls;Ligninolytic enzymes;Cytochrome P450 monooxygenases system;454-pyrosequencing;Funghi del marciume bianco;Micorisanamento;Bifenili policlorurati ligninolitici;Citocromo P450 monossigenasi;454-Pirosequenziamento
Issue Date: 5-Jun-2014
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 26. ciclo
Abstract: 
The remediation of persistent chlorinated aromatic compounds has become a priority of great
relevance due to the teratogenic, carcinogenic and endocrine-disrupting properties of these
xenobiotics. The use of biological methodologies for the clean-up of contaminated sites,
collectively referred to as “bioremediation”, has been gaining an increasing interest in recent years
because it represents an effective, cost-competitive and environmentally friendly alternative to the
physico-chemical and thermal treatments. In this respect, “white rot” fungi, an ecological subgroup
of filamentous fungi, display features that make them excellent candidates to design an effective
remediation technology (“mycoremediation”). In spite of this, fungi have not been widely exploited
for their metabolic capabilities and the mechanism by which they are able to degrade the
aforementioned pollutants has not been fully elucidated yet.
Within this frame, the present Ph.D thesis was aimed at:
i) assessing the efficiency of different mycoremediation strategies for the clean-up of a
polychlorinated biphenyl (PCBs)-contaminated soil;
ii) understanding the fungal degradation pathways of polychlorinated biphenyls and their major
metabolites, namely chlorobenzoic acids (CBAs) and hydroxylated polychlorinated biphenyls (OHPCBs).
i) The combination of chemical, toxicological and molecular biology techniques provided a
comprehensive evaluatation of the technical feasibility of selected remedial strategies. Physicochemical
properties (pH, soil texture, soil organic matter content, ect.) as well as the pollutant
bioavailability of three different PCB-contaminated soil samples from a dumpsite (bulk soil, topsoil
and rhizosphere soil) were assessed before undergoing both bioaugmentation (either with the white
rot fungus Pleurotus ostreatus or Irpex lacteus) and biostimulation (addition of a lignocellulosic
substrate) treatment. The inoculation of P. ostreatus in the rhizosphere soil was the most effective
treatment in terms of PCB degradation and detoxification. The involvement of both intracellular
and extracellular fungal enzymes in the biotransformation of PCBs was demonstrated by the
identification of several PCB degradation intermediates (i.e. chlorobenzoates, chlorobenzaldehydes,
chlorocresols, hydroxylated and methoxylated PCBs). Furthermore, new insights into the microbial
community structure, diversity and dynamics throughout the bioremediation processes were gained
with the combination of two culture-indipendent techniques: phospholipid fatty acids (PLFA) and
454-pyrosequencing analyses. PLFA analysis showed that either the introduction of allochthonous
fungi or the addition of non-inoculated lignocellulosic substrate stimulated the growth of the
resident bacterial populations, while the highest fungal concentration was achieved in P. ostreatustopsoil
microcosms in the incubation middle phase. Metagenomic analysis of bacterial community
revealed that Firmicutes relative abundance increased in Pleurotus ostreatus-bulk and -rhizosphere
soil microcosms; on the other hand, in I.lacteus-augmented microcosms, an initial increase of
Proteobacteria was observed whereas Bacteroidetes became dominant at the end of incubation.
Analysing the fungal community structure in bioaugmented soils, P.ostreatus showed a higher
ability than I. lacteus to compete with the autochthonous soil mycobiota. Indeed, P.ostreatus
sequences accounted to more than 90% of the total fungal amplicons along the whole incubation
period, thus proving the outstanding capability of this fungus to efficiently grow in PCBcontaminated
soils under non-sterile conditions. By contrast, the large majority of fungal sequences
in biostimulated microcosms belonged to the phyla Ascomycota and Zygomycota, with the
exception of the topsoil where members of the phylum Basidiomycota became predominant in the
later phase of the incubation
ii) Microsomal fractions rich in cytochrome P450 monooxygenase (CYP450) activities were
isolated from the white rot fungi Lentinus tigrinus and Pleurotus ostreatus to evaluate their
involvement in the biotransformation of CBAs and PCBs, respectively. In both cases, CYP450 was
firstly detected by carbon monoxide-binding spectrum, and then used to perform in vitro
degradation tests with selected compounds. Such intracellular enzymatic system was able to
degrade either a mixture of CBAs (L. tigrinus) or PCBs (P. ostreatus). Specifically, the
identification of a hydroxylated CBA confirmed the pivotal role of CYP450 in the initial
transformation of CBAs. Moreover, a semi-purified laccase obtained from P. ostreatus was capable
of degrading mono- and dichlorinated hydroxylated biphenyls, at different extent, either under
mediated or non-mediated conditions. The chemical structure of chlorinated organic pollutants,
namely the number and position of substituents, was the main factor affecting the extent of
degradation by both fungal intracellular and extracellular enzymes.

Il risanamento di matrici ambientali contaminate da composti organoclorurati recalcitranti è
divenuto una questione di fondamentale importanza a causa delle proprietà teratogeniche e
cancerogene di tali composti, nonchè per le loro caratteristiche di interferenti endocrini. A tal
proposito, le tecniche di risanamento biologico (biorisanamento) stanno riscuotendo un crescente
interesse negli ultimi anni rispetto ai più convenzionali metodi chimico-fisici in virtù della loro
comprovata sostenibilità ambientale ed economica. In particolare, i “funghi del marciume bianco”,
un sottogruppo ecologico dei funghi filamentosi specializzato nella degradazione della lignina,
presentano delle caratteristiche interessanti, tali da renderli degli ottimi candidati per la messa a
punto di tecniche di biorisanamento (micorisanamento). Tuttavia, le straordinarie capacità
metaboliche di questi funghi non sono ancora state sfruttate appieno per fini di recupero ambientale
ed i meccanismi attraverso i quali essi degradano i suddetti contaminanti clorurati non sono stati
chiariti in dettaglio.
Detto questo, la presente tesi di dottorato ha avuto come scopo:
i) la valutazione dell’efficacia di diverse tecniche di micorisanamento nel trattamento di suoli
contaminati da policlorobifenili (PCB);
ii) l’analisi dei meccanismi attraverso i quali i funghi del marciume bianco degradano (PCB) ed i
loro principali metaboliti, acidi clorobenzoici (CBA) e policlorobifenili idrossilati (OH-PCB).
i) La fattibilità tecnica delle strategie di risanamento oggetto di studio è stata valutata mediante una
combinazione di analisi chimiche, tossicologiche e biomolecolari. In una fase preliminare alle prove
di risanamento sono state esaminate le proprietà chimico-fisiche (pH, tessitura, sostanza organica
ecc.) di tre diversi campioni di suolo (suolo non di rizosfera, suolo superficiale e suolo di rizosfera)
provenienti da un sito di stoccaggio ed inoltre, è stata determinata la biodisponibilità dei
contaminanti in essi contenuti. Successivamente, tali matrici sono state sottoposte sia a trattamenti
di bioaumento fungino (con Pleurotus ostreatus o Irpex lacteus, due noti agenti della carie bianca
del legno) che di biostimolazione (attraverso l’aggiunta di ammendanti lignocellulosici). L’apporto
di P. ostreatus nel suolo di rizosfera è risultato il trattamento più efficace in termini di rimozione
dei PCB e detossificazione. In generale, l’identificazione di diversi prodotti di degradazione dei
PCB (acidi clorobenzoici, clorobenzaldeidi, cresoli clorurati, idrossi- e metossi-PCB) ha dimostrato
il coinvolgimento di diversi sistemi enzimatici fungini, intracellulari ed extracellulari, nella
biotrasformazione dei suddetti composti. Inoltre, l’utilizzo di due approcci coltura-indipendenti,
ovvero l’analisi degli acidi grassi di membrana (PLFA) ed il pirosequenziamento (sequenziamento
454), ha permesso di ottenere informazioni circa la struttura e l’evoluzione delle comunità
microbiche durante le prove di risanamento. L’analisi PLFA ha mostrato che l’aggiunta di inoculi
fungini o di semplice substrato lignocellulosico ha avuto un effetto stimolante sulla crescita della
popolazione batterica del suolo e che la più alta densità fungina è stata riscontrata nel suolo
superficiale bioaumentato con P. ostreatus a metà del periodo di incubazione stabilito.
L’analisi della comunità batterica effettuata tramite metagenomica ha rivelato che il bioaumento di
P. ostreatus sia nel suolo non di rizosfera che di rizosfera ha indotto un aumento dell’abbondanza
relativa del phylum Firmicutes, mentre nei microcosmi inoculati con I. lacteus, i phyla dominanti
erano Proteobacteria e Bacteroidetes, rispettivamente nelle fasi iniziali e finali del trattamento.
Dall’analisi della comunità fungina, P. ostreatus è risultato migliore di I. lacteus nel competere con
la microflora autoctona dei suoli. In particolare, P. ostreatus ha rappresentato, per l’intero periodo
d’incubazione, oltre il 90% delle sequenze fungine nei tre i suoli in cui è stato introdotto,
dimostrando di saper crescere in suoli contaminati da PCB in condizioni di non sterilità. Di contro,
nei suoli biostimolati l’aggiunta di ammendante in forma sterile ha favorito la crescita di funghi
appartenenti ai phyla Ascomycota e Zygomycota, con la sola eccezione del suolo superficiale in cui
il phylum Basidiomycota è diventato predominante nella seconda metà del trattamento.
ii) Al fine di valutare il coinvolgimento del sistema enzimatico citocromo P450 monossigenasi
(CYP450) nella degradazione di CBA e PCB, frazioni microsomali ricche di attività CYP450 sono
state isolate dai funghi Lentinus tigrinus e Pleurotus ostreatus. L’attività del CYP450 è stata
quantificata spettrofotometricamente al fine di effettuare successivamente delle prove di
degradazione in vitro con i composti selezionati. Tale sistema enzimatico intracellulare è stato
capace di degradare sia una miscela di CBA (L. tigrinus) che di PCB (P. ostreatus). In particolare,
l’identificazione di una forma idrossilata di un acido clorobenzoico ha confermato il diretto
coinvolgimento del CYP450 nelle fasi iniziali di trasformazione dei CBA. Inoltre, la degradazione
di forme idrossilate di bifenili mono- e di-clorurati da parte di una laccasi semipurificata, estratta da
P. ostreatus, è stata dimostrata sia in presenza che in assenza di uno specifico mediatore. La
struttura chimica dei suddetti contaminanti ha rappresentato il principale fattore determinante le
capacità degradative degli enzimi fungini sia intracellulari che extracellulari.
Description: 
Dottorato di ricerca in Scienze ambientali
URI: http://hdl.handle.net/2067/2911
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