Investigating the role of Werner syndrome protein in the activation of the ATR-dependent checkpoint in response to mild replication stress

Abstract

Werner syndrome (WS) is a human chromosomal instability and cancer-prone disease caused by mutations in the WRN gene, encoding for the Werner syndrome protein (WRN) that is a member of the RecQ helicases. It has been previously proposed that WRN helicase activity is a key regulator of common fragile site (CFS) stability, which are the preferential targets of genome instability in precancerous lesions. Moreover, it is known that, under mild replication stress inducing by low dose of Aphidicolin (Aph), WRN and ATR act in a common pathway preventing accumulation of DNA breaks at CFS. Despite WS cells exhibit an ATR-like instability at CFS, and that WRN has been found phosphorylated by ATR under robust replication stress caused by treatments with hydroxyurea (HU), there is no evidence of a functional requirement of WRN in the establishment of the replication checkpoint response to mild replication stress, like that inducing CFS expression. The aim of this study was to analyze the functional requirement of WRN in the ATR-dependent checkpoint activation under mild replication stress using low doses of aphidicolin treatments. Our data establish that WRN plays a role in mediating CHK1 activation, a principal target of the ATR kinase activity under replication stress. Moreover, our results demonstrate that WRN and the ATR-mediated WRN phosphorylation are required to phosphorylate CHK1, as they are important for chromatin loading of checkpoint mediators under untreated as well as Aph-treatment conditions. In contrast, although WRN helicase activity is not required for CHK1 phosphorylation, it results essential in supporting replication fork recovery, possibly by the resolution of DNA secondary structures, thus promoting CFS stability. Analysis of replication fork dynamics shows that loss of WRN checkpoint mediator function, as well as of WRN helicase activity, hamper replication fork progression, and lead to new origin activation to allow recovery from replication slowing upon mild replication stress. Furthermore, bypass of WRN checkpoint mediator function through over-expression of a phospho-mimic form of CHK1 restores fork progression and chromosome stability to the wild-type levels. Loss of WRN also greatly hampers the phosphorylation of histone H2AX (γ-H2AX), which is the earlier target of ATR kinase following replication stress. Indeed, although, upon mild replication stress, in wild-type cells H2AX is activated by ATR in a time-dependent manner, its phosphorylation is reduced in WS cells, further confirming defects in the ATR signalling. Furthermore in this study, others cellular consequences of WRN loss have been explored in response to mild replication stress. Evidences demonstrate that the absence of WRN leads to an ATM pathway activation, which is harmful to the cells, as confirmed by positive effects obtained on cellular survival and chromosomal damage by ATM inhibition in the last part of the treatment with Aph. One way by which ATM inhibition could protect genome stability in WS cells is the recovery of CHK1 defective activation. Noteworthy, in cells expressing the unphosphorylable form of WRN, WSWRN6A, ATM inhibition is not able to rescue CHK1 activation, possibly because the presence of the protein, although mutated, could prevent the activation of such alternative pathway. Furthermore, WRN deficiency leads the formation of 53BP1 foci in S phase, after prolonged mild replication stress. The increase of 53BP1 foci in all cell cycle phases has been previously associated with CHK1 depletion, and so it is consistent with defective CHK1 activation observed in WRN-deficient cells following Aph exposure. These findings suggest that, in S phase, in absence of the ATR checkpoint activation, 53BP1 recruitment in foci is instrumental in attracting other proteins implicated in the response to mild replication stress damage. Therefore, our results suggest a novel role of WRN as checkpoint mediator in response to moderate replication stress and give strong mechanistic support to the notion that defective fork repair/recovery undermines integrity of chromosomes at CFS. This study also unveils a complicated network in which several proteins work tightly linked together. Loss of one protein means altering this network and changing the interaction among proteins. Moreover, our findings may contribute to shed light into the origin of chromosome instability in WS and more in general to clarify how genome instability accumulates in pre-neoplastic lesions, thus promoting cancer development.

Werner (WS) è una sindrome genetica umana caratterizzata da instabilità cromosomica e predisposizione al cancro, ed è causata da mutazioni nel gene WRN, che codifica per la proteina omonima (WRN), membro della famiglia di DNA elicasi RecQ. È stato proposto che l’attività elicasisa della proteina WRN sia un regolatore chiave della stabilità dei siti fragili comuni (CFS), che sono delle regioni del genoma umano che esibiscono in modo preferenziale instabilità genomica in lesioni precancerose. È, inoltre, noto che in condizioni di stress replicativo moderato, indotte da basse dosi di afidicolina, WRN agisce in collaborazione con la proteina ATR, per prevenire l’accumulo di rotture al DNA all’interno dei CFS. Nonostante le cellule WS esprimano una instabilità ai CFS simile a quella osservata in cellule in cui ATR è depleto, ed è stato dimostrato che WRN è fosforilato da ATR a in risposta a stress replicativo robusto, come quello indotto da idrossiurea, non vi sono fino ad ora evidenze di un coinvolgimento di WRN nell’attivazione del checkpoint della replicazione a seguito di stress replicativo moderato, come quello che provoca rotture dei CFS. Scopo di questo lavoro è proprio analizzare tale possibile coinvolgimento di WRN nell’attivazione del checkpoint ATR dipendente in risposta a condizioni di stress replicativo moderato, indotte da basse dosi di afidi colina, un inibitore delle polimerasi replicative. I dati ottenuti dimostrano che WRN ha un ruolo nell’attivazione di CHK1, che è uno dei target principali dell’attività chinasica di ATR dopo stress replicativo. I dati sperimentali dimostrano anche che la presenza di WRN e la sua fosforilazione ATR mediata sono richieste affinché CHK1 sia fosforilato a sua volta da ATR, in quanto ambedue risultano fondamentali per l’ancoraggio alla cromatina delle proteine mediatrici del checkpoint, sia in condizioni di controllo, che di trattamento. Al contrario l’attività elicasica di WRN non è necessaria per la fosforilazione di CHK1, ma risulta importante nel supportare il recupero delle forche replicative stallate, probabilmente risolvendo strutture secondarie di DNA, e di conseguenza contribuendo alla stabilità dei CFS. L’analisi della dinamica di replicazione mostra che la perdita della funzione di mediatore del checkpoint di WRN ostacola la progressione della forca replicativa e provoca l’attivazione di nuove origini, al fine di recuperare il rallentamento delle replicazione dovuto allo stress re plicativo moderato. Eludere la funzione di mediatore del checkpoint di WRN, attraverso l’overespressione di un mutante di CHK1 fosfomimetico, ripristina la progressione della forca replicativa e la stabilità cromosomica a livelli del tutto simili a una condizione wild type. La mancanza di WRN ostacola anche la fosforilazione dell’istone H2AX (γ-H2AX), che è un target precoce della chinasi ATR dopo stress replicativo: infatti, mentre in condizioni wild type l’istone è fosforilato da ATR in modo tempo dipendente, la sua fosforilazione risulta ridotta in cellule WS, confermando ulteriormente un difetto di segnalazione del pathway controllato da ATR. In questo studio sono state analizzate anche ulteriori conseguenze della perdita di WRN sulla risposta allo stress re plicativo i tipo moderato. Le evidenze dimostrano che l’assenza di WRN induce l’attivazione di un pathway ATM dipendente, che risulta dannoso per le cellule, poiché la sua inibizione, nell’ultima parte del trattamento con afidi colina, mostra effetti positivi sia sulla sopravvivenza cellulare, che sul danno cromosomico. Un modo attraverso il quale l’inibizione di ATM potrebbe proteggere le cellule WS è il recupero dell’attivazione di CHK1, dopo trattamento con afidicolina. Va sottolineato che, in cellule che esprimono il mutante non fosforilabile di WRN, WSWRN6A, l’inibizione di ATM non riesce a portare ad un recupero dell’attivazione di CHK1, forse a causa del fatto che, la presenza della proteina, seppur mutata, può prevenire l’innesco di un eventuale pathway alternativo. In aggiunta, la mancanza di WRN provoca la formazione di foci 53BP1 positivi in fase S, in condizioni di stress replicativo moderato prolungato. L’incremento di foci 53BP1 positivi in tutte le fasi del ciclo cellulare, è stato associato precedentemente in letteratura con la deplezione di CHK1, ed è, quindi, consistente con la difettiva attivazione di CHK1 osservata in cellule WRN-deficienti dopo trattamenti con afidicolina. Queste osservazioni suggeriscono che, in assenza di una attivazione del checkpoint controllata da ATR, il reclutamento in foci di 53BP1 possa avere un ruolo nell’attrarre altre proteine implicate nella risposta al danno provocato da stress re plicativo moderato. Nel loro insieme, i risultati suggeriscono un nuovo ruolo di WRN come mediatore del checkpoint in risposta a stress replicativo moderato, e supportano il fatto che una difettiva riparazione o un difettivo recupero delle forche replicative minaccia gravemente l’integrità dei cromosomi ai CFS. Questo studio svela, inoltre, l’esistenza di un complicato network in cui una serie di proteine, tra cui WRN, lavorano in stretta collaborazione. Perdere una sola di queste proteine significa alterare l’intero network e provocare un cambiamento nelle interazioni proteiche in esso previste. In particolar modo, i dati di questo studio possono contribuire a chiarire l’origine dell’instabilità cromosomica nelle cellule WS, e, più in generale, a capire come l’instabilità genomica si accumuli in lesioni preneoplastiche, e quindi come possa promuovere lo sviluppo di formazioni tumorali.