Identification of novel mutant P53 functions involved in the modulation of the tumour microenvironment

Abstract

The tumour suppressor TP53 is one of the most frequently mutated genes in human cancers. The majority of these mutations, located into the DNA binding domain, results in the production of mutated proteins that lose the wild-type functionality but can acquire new oncogenic functions (gain-of-function, GOF). We previously showed that p53R273H mutation promotes tumour growth, stromal invasion and angiogenesis in xenografted HT-29, suggesting a role of mutant p53 in the modulation of the tumour microenvironment (TME). In the first part of the study it has been explored whether p53 mutants might have role in modulating cytokines/secretory factors production. Cytokines profile analyses on conditioned media derived from a panel of human cancer cell lines showed that endogenous mutant p53 depletion increases significantly the secreted form of IL-1Ra (sIL-1Ra). The sIL-1Ra is a naturally occurring anti-inflammatory cytokine that acts as a specific antagonist of IL-1β. Confirmatory analyses showed that mutant p53 represses sIL-1Ra at transcriptional level, identifying by ChIP assays specific sIL-1Ra regulatory regions required for mutant p53 physical recruitment. Moreover, further studies identified the transcriptional co-factor MafF as a required player to recruit by protein-protein interaction mutant p53 on the sIL-1Ra promoter. Indeed, we showed that MafF endogenous depletion (RNAi) impairs mutant p53 recruitment on the sIL-1Ra promoter restoring its activity. Functional studies showed that mutant p53 contributes to maintain a prone inflammatory response by sIL-1Ra down-regulation. Indeed, either mutant p53 depletion or recombinant sIL-1Ra (Kineret) delivery impairs IL-1b response in vitro and in vivo. Taken together, these results reveal a novel oncogenic mutant p53 GOF activity, exerted by the repression of sIL-1Ra that contributes to generate a pro-inflammatory tumour microenvironment promoting tumour malignancy. The second part of the study has been dedicated to the identification and characterization of a more physiological experimental model, as immunocompetent mice, to better study mutant p53/TME crosstalk. The analysis of chemically induced mammary tumours in p53+/R172H, p53R172H/R172H and p53+/+ genetically engineered mutant p53R172H knock-in mice, showed that mutant p53 occurrence strongly impacts on tumour onset, tumour differentiation and increases the recruitment of macrophages into the tumour milieu. Finally, in order to identify a feasible, less expensive and more reliable system than the genetically engineered mouse, we focused on the generation and initial characterization of a syngeneic orthotopic model of breast cancer in immunocompetent mice, by using a breast cancer cell line, named 44-1, derived from a p53R172H/R172H chemically induced mammary tumour. This model will be useful to confirm the whole data obtained and to examine in depth the fine regulation exerted by mutant p53 on the tumour microenvironment.

Il gene oncosoppressore TP53 è uno dei geni più frequentemente mutati nei tumori umani. La maggioranza delle mutazioni è localizzata all’interno del dominio di legame al DNA e da origine a proteine che perdono la loro funzionalità wild type, ma che possono acquisire nuove funzioni oncogeniche (Gain of function, GOF). E’ stato precedentemente dimostrato come la mutazione di p53 R273H sia in grado di promuovere la crescita tumorale, l’invasione del tumore da parte dello stroma, e l’angiogenesi in tumori xenograft generati utilizzando la linea cellulare HT29 (adenocarcinoma del colon), suggerendo un ruolo della p53 mutata nella modulazione del microambiente tumorale. Nella prima parte dello studio abbiamo analizzato il ruolo della p53 mutata nell’espressione di fattori secretori/citochine. L’analisi delle citochine, effettuata sui terreni condizionati derivanti da un pannello di linee cellulari di tumore umano, ha evidenziato che il silenziamento della p53 mutata induce un aumento significativo della forma secreta della citochina IL-1Ra (sIL-1Ra). La sIL-1Ra è una citochina anti-infiammatoria che agisce antagonizzando il ruolo della citochina pro-infiammatoria IL-1β. Successive analisi hanno dimostrato che la p53 mutata reprime la sIL-1Ra a livello trascrizionale. Esperimenti di ChIP hanno dimostrato che la p53 mutata è reclutata sul promotore della sIL-1Ra su regioni regolatorie specifiche. Abbiamo inoltre identificato sul promotore della sIL-1Ra il co-fattore trascrizionale MafF che, interagendo con la proteina p53 mutata è responsabile del suo reclutamento sul promotore della sIL-1Ra. Abbiamo infatti dimostrato che l’interferenza dell’ RNA di MafF (MafF RNAi) impedisce il reclutamento della p53 mutata sul promotore della sIL-1Ra, ripristinandone l’attività. Analisi funzionali hanno dimostrato che, attraverso la repressione della sIL-1Ra, la p53 mutata contribuisce a mantenere una attiva risposta infiammatoria alla IL-1β: sia la deplezione della p53 mutata che la somministrazione della IL-1Ra ricombinante umana riducono la risposta alla IL-1β in vitro ed in vivo. I risultati ottenuti indentificano una nuova attività oncogenica acquisita dalla p53 mutata, che viene esercitata attraverso la repressione della sIL-1Ra, contribuendo a generare un microambiente tumorale che favorisce la progressione del cancro. La seconda parte del lavoro è stata dedicata alla identificazione ed alla caratterizzazione di modelli murini immunocompetenti più fisiologici per lo studio del rapporto tra la p53 mutata ed il microambiente circostante. L’analisi di tumori alla mammella indotti chimicamente in topi geneticamente ingegnerizzati (p53+/R172H, p53R172H/R172H and p53+/+ Knock-in mice) mostra che la presenza della p53 mutata ha un forte impatto sullo sviluppo ed il differenziamento del tumore ed è inoltre correlata alla presenza di macrofagi nel microambiente tumorale. Infine, con lo scopo di identificare un sistema meno costoso e più affidabile rispetto ai topi geneticamente ingegnerizzati, lo studio è stato focalizzato sulla generazione ed iniziale caratterizzazione di un modello murino ortotopico immunocompetente di cancro alla mammella, utilizzando una linea cellulare murina di tumore alla mammella, chiamata 44-1, derivante da un tumore indotto chimicamente in topi p53R172H/R172H . Questo modello risulterà utile per confermare tutti i dati ottenuti precedentemente e per esaminare in maniera approfondita la fine regolazione esercitata dalla p53 mutata sul microambiente tumorale.