Cell-matrix interactions: cell culturing in collagen-based scaffolds

Abstract

The primary aim of tissue engineering is to develop bio-functional matrices that mimic native tissues in vitro and hep to stimulate healing under normal or chronic situations. Collagen based scaffolds are widely used as temporary or permanent coverings to help dermal wound healing. Under natural conditions, wound healing is affected by many factors, including different cell types, growth factors and several components of the extracellular matrix. Due to the complexity of the cell-to-matrix interaction, many cell-based mechanisms are not yet properly known. The aim of this work was to study the ultrastructure of equine collagen type I scaffolds that are used in tissue regeneration. Furthermore, to simulate the healing process in vitro the mechanisms by which a stabilized cell line of the connective tissue interacts with such supports were also carefully studied. Scanning (SEM) and transmission electron microscopy (TEM) techniques were used to assess the structural features that this collagen scaffold should have to support cell migration and interaction with the host tissue. This study has clearly demonstrated that fibroblasts NIH3T3 can actually migrate through the collagen matrix by embracing collagen fibers with long filopodia and fold them back onto the cell surface to form large intracellular vacuoles. Gelatin Zymography and Western Blot techniques were also used to verify what role gelatinase B or MMP-9 play in the elaboration of the collagen matrix. Although the activation of this matrix-metalloproteinase is not conditioned by the presence of the collagen scaffold, the extracellular release of MMP-9 and its diffusion onto the collagen matrix was found to be highly correlated with shedding of the microvesicles from the cell membrane. This finding suggests that the MMP-9 activation and the following degradation could be triggered by the release of microvesicles. Their interaction with the prosthetic collagen is probably a precondition for fibroblasts to laying new extracellular matrix during wound healing. 1 Several comparative studies were carried out to verify the extent by which native equine collagen is structurally modified if combined with other elements (active substances or nanoparticles). Data have shown that, even under these conditions, collagen maintain enough structural stability to sustain cellular migration and proliferation. This finding opens the way to develop innovative dermal substitutes by making collagen bio-functionalized with probes specifically developed to address it toward certain target tissues. On the whole, the morpho-functional analysis carried out in this study demonstrates that equine type I collagen-based matrices provide conditions favorable for mimicking wound healing in vitro. In spite of the complexity of the process in vivo, and the variety of factors actually involved in wound healing, it is conceivable that the type of cell-to-matrix interactions – as due to migration, adhesion and proliferation – envisaged in this study may represent the first step in a cascade of reactions leading to tissue remodeling. Given this possibility, the experimental conditions worked out in this thesis for the establishment of a 3D culture in a collagen matrix may constitute a first pivotal attempt for testing additional cell parameters under conditions that could not be adequately controlled in vivo.

L’ingegneria tissulare attualmente è volta allo sviluppo di matrici bio-funzionali in grado di mimare il tessuto nativo e di stimolare i processi di guarigione in situazioni normali o croniche. Matrici a base di collagene sono ampiamente usate come coperture temporanee o permanenti per aiutare la guarigione di ferite cutanee. In condizioni normali, il processo di guarigione è influenzato da molti fattori tra cui diversi tipi di cellule, fattori di crescita e diversi componenti della matrice extracellulare. Data la complessità della interazione cellula-matrice, molti meccanismi cellulari di base non sono ancora propriamente noti. Lo scopo di questo lavoro è stato studiare la morfologia e l’ultrastruttura di supporti a base di collagene equino di tipo I, usati nella rigenerazione dei tessuti. Inoltre, per simulare il processo di guarigione in vitro, sono stati ampiamente studiati i meccanismi attraverso i quali linee cellulari stabilizzate del tessuto connettivo interagiscono con tali supporti. Tecniche di Microscopia Elettronica a Scansione (SEM) e a Trasmissione (TEM) sono state utilizzate per valutare le caratteristiche strutturali che questa matrice di collagene deve avere per supportare la migrazione delle cellule e l'interazione con il tessuto ospite. Questo studio ha chiaramente dimostrato che fibroblasti NIH3T3 migrano attraverso la matrice avvolgendo le fibre di collagene mediante lunghi fillopodi che si ripiegano sulla superficie cellulare a formare ampi vacuoli intracellulari. Tecniche di Gelatin Zymography e Western Blot sono stati utilizzate per verificare quale sia il ruolo della gelatinasi B o MMP-9 nella elaborazione della matrice di collagene. Sebbene l'attivazione di questa metalloproteinasi di matrice non è condizionata dalla presenza di collagene protesico, il rilascio extracellulare di MMP-9 e la sua diffusione sulla matrice è risultato fortemente correlato allo spargimento di microvescicole di membrana. Questo risultato suggerisce che l'attivazione della MMP-9 e la sua successiva degradazione potrebbero essere innescati dal rilascio di microvescicole. La loro interazione con il collagene protesico è presumibilmente presupposto, nei fibroblasti, per la deposizione di nuova matrice extracellulare nel corso della guarigione delle ferite. Diversi studi comparativi sono stati effettuati per verificare la misura in cui il collagene nativo equino è strutturalmente modificato se combinato con altri elementi (sostanze attive o nanoparticelle). I dati hanno dimostrato che, anche in queste condizioni, il collagene mantiene sufficiente stabilità strutturale per sostenere la migrazione e la proliferazione cellulare. La possibilità di bio-funzionalizzare questo tipo di collagene, senza alterarne le caratteristiche, offre la possibilità di sviluppare sostituti dermici sempre più innovativi in grado di supportare tessuti bersaglio differenti. Nel complesso, l'analisi morfo-funzionale effettuato in questo studio dimostra che le matrici a base di collagene equino tipo I forniscono condizioni favorevoli per simulare la guarigione delle ferite in vitro. Nonostante la complessità del processo in vivo e la varietà dei fattori effettivamente coinvolti nella guarigione delle ferite, è concepibile che il tipo di interazioni cellula-matrice - come migrazione, adesione e proliferazione - previste in questo studio possano rappresentare il primo passo in una cascata di reazioni che portano al rimodellamento tissutale. Tenuto conto di questa eventualità, le condizioni sperimentali elaborate in questa tesi per la creazione di una cultura in 3D in una matrice di collagene, può costituire un primo tentativo fondamentale per testare parametri cellulari supplementari in condizioni che non possono essere adeguatamente controllate in vivo.