Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2883
Title: Cell - matrix interactions: cell culturing in collagen-based scaffolds
Other Titles: Interazioni cellula-matrice: culture cellulari in supporti a base di collagene
Authors: Laghezza Masci, Valentina
Keywords: Collagen matrix;Electron microscopy;In vitro culture;Microvesicles;Fibroblasts;Matrici in collagene;Microscopia elettronica;Colture in vitro;Microvescicole di membrana;Fibroblasti;BIO/05
Issue Date: 16-Jun-2015
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 27. ciclo
Abstract: 
The primary aim of tissue engineering is to develop bio-functional matrices that
mimic native tissues in vitro and hep to stimulate healing under normal or chronic
situations. Collagen based scaffolds are widely used as temporary or permanent
coverings to help dermal wound healing. Under natural conditions, wound healing is
affected by many factors, including different cell types, growth factors and several
components of the extracellular matrix. Due to the complexity of the cell-to-matrix
interaction, many cell-based mechanisms are not yet properly known. The aim of this
work was to study the ultrastructure of equine collagen type I scaffolds that are used in
tissue regeneration. Furthermore, to simulate the healing process in vitro the
mechanisms by which a stabilized cell line of the connective tissue interacts with such
supports were also carefully studied.
Scanning (SEM) and transmission electron microscopy (TEM) techniques were
used to assess the structural features that this collagen scaffold should have to support
cell migration and interaction with the host tissue. This study has clearly demonstrated
that fibroblasts NIH3T3 can actually migrate through the collagen matrix by embracing
collagen fibers with long filopodia and fold them back onto the cell surface to form
large intracellular vacuoles.
Gelatin Zymography and Western Blot techniques were also used to verify what
role gelatinase B or MMP-9 play in the elaboration of the collagen matrix. Although the
activation of this matrix-metalloproteinase is not conditioned by the presence of the
collagen scaffold, the extracellular release of MMP-9 and its diffusion onto the collagen
matrix was found to be highly correlated with shedding of the microvesicles from the
cell membrane. This finding suggests that the MMP-9 activation and the following
degradation could be triggered by the release of microvesicles. Their interaction with
the prosthetic collagen is probably a precondition for fibroblasts to laying new
extracellular matrix during wound healing.
1
Several comparative studies were carried out to verify the extent by which native
equine collagen is structurally modified if combined with other elements (active
substances or nanoparticles). Data have shown that, even under these conditions,
collagen maintain enough structural stability to sustain cellular migration and
proliferation. This finding opens the way to develop innovative dermal substitutes by
making collagen bio-functionalized with probes specifically developed to address it
toward certain target tissues.
On the whole, the morpho-functional analysis carried out in this study
demonstrates that equine type I collagen-based matrices provide conditions favorable
for mimicking wound healing in vitro. In spite of the complexity of the process in vivo,
and the variety of factors actually involved in wound healing, it is conceivable that the
type of cell-to-matrix interactions – as due to migration, adhesion and proliferation –
envisaged in this study may represent the first step in a cascade of reactions leading to
tissue remodeling. Given this possibility, the experimental conditions worked out in this
thesis for the establishment of a 3D culture in a collagen matrix may constitute a first
pivotal attempt for testing additional cell parameters under conditions that could not be
adequately controlled in vivo.

L’ingegneria tissulare attualmente è volta allo sviluppo di matrici bio-funzionali in
grado di mimare il tessuto nativo e di stimolare i processi di guarigione in situazioni
normali o croniche. Matrici a base di collagene sono ampiamente usate come coperture
temporanee o permanenti per aiutare la guarigione di ferite cutanee. In condizioni
normali, il processo di guarigione è influenzato da molti fattori tra cui diversi tipi di
cellule, fattori di crescita e diversi componenti della matrice extracellulare. Data la
complessità della interazione cellula-matrice, molti meccanismi cellulari di base non
sono ancora propriamente noti. Lo scopo di questo lavoro è stato studiare la morfologia
e l’ultrastruttura di supporti a base di collagene equino di tipo I, usati nella
rigenerazione dei tessuti. Inoltre, per simulare il processo di guarigione in vitro, sono
stati ampiamente studiati i meccanismi attraverso i quali linee cellulari stabilizzate del
tessuto connettivo interagiscono con tali supporti.
Tecniche di Microscopia Elettronica a Scansione (SEM) e a Trasmissione (TEM)
sono state utilizzate per valutare le caratteristiche strutturali che questa matrice di
collagene deve avere per supportare la migrazione delle cellule e l'interazione con il
tessuto ospite. Questo studio ha chiaramente dimostrato che fibroblasti NIH3T3
migrano attraverso la matrice avvolgendo le fibre di collagene mediante lunghi fillopodi
che si ripiegano sulla superficie cellulare a formare ampi vacuoli intracellulari.
Tecniche di Gelatin Zymography e Western Blot sono stati utilizzate per verificare
quale sia il ruolo della gelatinasi B o MMP-9 nella elaborazione della matrice di
collagene. Sebbene l'attivazione di questa metalloproteinasi di matrice non è
condizionata dalla presenza di collagene protesico, il rilascio extracellulare di MMP-9 e
la sua diffusione sulla matrice è risultato fortemente correlato allo spargimento di
microvescicole di membrana. Questo risultato suggerisce che l'attivazione della MMP-9
e la sua successiva degradazione potrebbero essere innescati dal rilascio di
microvescicole. La loro interazione con il collagene protesico è presumibilmente
presupposto, nei fibroblasti, per la deposizione di nuova matrice extracellulare nel corso
della guarigione delle ferite.
Diversi studi comparativi sono stati effettuati per verificare la misura in cui il
collagene nativo equino è strutturalmente modificato se combinato con altri elementi
(sostanze attive o nanoparticelle). I dati hanno dimostrato che, anche in queste
condizioni, il collagene mantiene sufficiente stabilità strutturale per sostenere la
migrazione e la proliferazione cellulare. La possibilità di bio-funzionalizzare questo tipo
di collagene, senza alterarne le caratteristiche, offre la possibilità di sviluppare sostituti
dermici sempre più innovativi in grado di supportare tessuti bersaglio differenti.
Nel complesso, l'analisi morfo-funzionale effettuato in questo studio dimostra che
le matrici a base di collagene equino tipo I forniscono condizioni favorevoli per
simulare la guarigione delle ferite in vitro. Nonostante la complessità del processo in
vivo e la varietà dei fattori effettivamente coinvolti nella guarigione delle ferite, è
concepibile che il tipo di interazioni cellula-matrice - come migrazione, adesione e
proliferazione - previste in questo studio possano rappresentare il primo passo in una
cascata di reazioni che portano al rimodellamento tissutale. Tenuto conto di questa
eventualità, le condizioni sperimentali elaborate in questa tesi per la creazione di una
cultura in 3D in una matrice di collagene, può costituire un primo tentativo
fondamentale per testare parametri cellulari supplementari in condizioni che non
possono essere adeguatamente controllate in vivo.
Description: 
Dottorato di ricerca in Evoluzione biologica e biochimica
URI: http://hdl.handle.net/2067/2883
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