L’identificazione di nuovi interattori di CSB rivela un suo potenziale ruolo nel metabolismo del RNA e nel rimodellamento della cromatina

Abstract

La proteina CSB, un membro della famiglia SWI/SNF di rimodellatori della cromatina ATP-dipendenti, svolge un ruolo nella sottovia di riparazione per escissione nucleotidica (NER) nota come riparazione associata alla trascrizione (TCR). Il gene csb è frequentemente mutato nella sindrome di Cockayne, una malattia autosomica recessiva annoverata tra le sindromi progeroidi umane di tipo segmentale e caratterizzata da una mancata crescita e degenerazione di molteplici organi. Sebbene sia stata inizialmente caratterizzata come proteina di riparazione del danno al DNA, recenti studi hanno dimostrato che la mancanza di CSB risulta avere effetti pleiotropici. L’identificazione di nuove proteine appartenenti all’interattoma di CSB potrebbe essere utile per definire sue nuove funzioni molecolari, oltre quelle già note, al fine di spiegare le basi molecolari del fenotipo Cockayne che certamente non può essere ricondotto nella sua vastità a un difetto di riparazione del danno al DNA. In questo studio, abbiamo utilizzato la tecnologia della Purificazione per Affinità in Tandem (Tandem Affinity Purification, TAP) associata alla spettrometria di massa e a studi di co-immunoprecipitazione per identificare e caratterizzare nuove proteine che interagiscono con CSB. Nel nostro approccio, un TAP tag è stato fuso con il cDNA di CSB e il costrutto è stato successivamente trasfettato in cellule ospiti (CS1AN) per poi verificare il rescue funzionale della sensibilità agli UV caratteristica delle cellule CSB. Le proteine associate con la proteine di fusione CSB-TAP sono state poi isolate attraverso due passaggi sequenziali di purificazione per affinità. Infine, le proteine isolate sono state separate mediante gel di poliacrilamide SDS e analizzate mediante spettrometria di massa. Le proteine co-purificate mediante TAP e identificate con la spettrometria di massa sono state sottoposte a successivi esperimenti di co-immunoprecipitazione per validarne la presenza negli eluati con CSB-TAP. Il nostro studio ha rivelato 33 proteine per le quali non era ancora nota l’interazione con CSB. Questi nuovi interattori suggeriscono un potenziale ruolo di CSB nel metabolismo del RNA, nella regolazione trascrizionale e nel mantenimento della dinamicità e dell’integrità della cromatina. Infine, utilizzando il sistema Lac Operator / Lac Repressor abbiamo voluto studiare alcuni effetti del reclutamento di CSB ai loci LacR. Essendo CSB una proteina con attività ATPasica coinvolta nel rimodellamento della cromatina oltre che nell’attivazione dell’espressione genica, abbiamo voluto verificare se il suo reclutamento determinasse un cambiamento nello stato di acetilazione della cromatina verificando che lo stesso effetto non fosse presente ai foci mancanti di CSB.

The CSB protein, a member of the SWI/SNF ATP dependent chromatin remodeling family of proteins, plays a role in a sub-pathway of nucleotide excision repair (NER) known as transcription coupled repair (TCR). CSB is frequently mutated in Cockayne syndrome group B, a segmental progeroid human autosomal recessive disease characterized by growth failure and degeneration of multiple organs. Though initially classified as a DNA repair protein, recent studies have demonstrated that the loss of CSB results in pleiotropic effects. The identification of novel proteins belonging to the CSB interactome may be useful not only for predicting the molecular basis for diverse pathological symptoms of CS-B patients but also for unraveling the functions of CSB in addition to its original role in DNA repair. In this study, we performed tandem affinity purification (TAP) technology coupled with mass spectrometry and coimmunoprecipitation studies to identify and characterize the proteins that interact with CSB-TAP. In our approach, a TAP tag was fused with CSB cDNA and the construct was subsequently transfected into suitable host cells (CS1AN cells) and we demostrated functional rescue of the UV sensitivity characteristic of CSB. Our approach revealed 33 proteins that were not previously known to interact with CSB. These newly identified proteins indicate potential roles for CSB in RNA metabolism, repression and activation of transcription process and the maintenance of chromatin dynamics and integrity. Proteins associated with CSB-TAP fusion protein were then isolated trough two sequential affinity purification steps. Finally, the isolated proteins were size fractionated on SDS polyacrylamide gels and analyzed by mass spectrometry. Identified proteins were analyzed by co-immunoprecipitation to validate their copurification with CSB-TAP. Using the Lac Operator/Lac Repressor system we studied some effects of CSB recruiment to LacR foci. Being CSB a chromatin remodeling as transcriptional activator, we verified if its recruiment could determine a change in the acetylated state of chromatin, checking that the same effect was not present at the foci lacking of CSB. By immunofluorescence we observed that in cells expressing the LacR-CSB fusion protein the acetylation signal accumulates in nuclear LacR foci, while it ’ s homogeneous in the nucleus of cells expressing only LacR protein.