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Title: Bioanalytical Method Validation. Applicazione di un metodo di validazione per l’analisi di droghe d’abuso su matrice urinaria
Other Titles: Bioanalytical Method Validation. Application of a validation method for the analysis of addiction substances on urine matrix
Authors: Giovagnoli, Maria
Keywords: Cromatografia;Spettrometria di massa;Sostanza d'abuso;Matrice urinaria;Curva di calibrazione;Chromatography;Mass spectrometry;Addiction substance;Urine matrix;Calibration curve;BIO/02
Issue Date: 16-May-2014
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 27. ciclo
Abstract: 
Il presente lavoro è sorto dall’esperienza e dagli studi di dottorato presso l’UOC di Tossicologia del Laboratorio Analisi Cliniche dell’Ospedale di Belcolle, ASL Viterbo.
In particolare si è messo a punto il metodo di validazione che si applica nella ricerca di molti analiti nel corso della frequente conferma su matrice urinaria attestante la presenza di tracce seppur minima degli stessi, come si usa fare appunto nello screening delle sostanze d’abuso.
La prima parte del lavoro descrive l’attività quotidiana di un Laboratorio di tossicologia forense nell’ambito della diagnostica medico-legale, dalle Normative in vigore alle Linee-guida e alle Norme ISO per la certificazione.
Si segue in buona sostanza l’iter cui è sottoposto il Campione Biologico: dalla sua scelta alla raccolta del medesimo e alla catena di custodia, garanzia della genuinità del procedimento da tutti i punti di vista.
Riguardo alle Analisi Chimico-Tossicologiche vere e proprie accenno alla scelta del tipo di analisi, distinguendo quelle di primo screening (metodi immunochimici) da quelle di conferma (gas-cromatografia e cromatografia liquida, accoppiata alla spettrometria di massa) che riguardano peculiarmente il presente lavoro. Fissato pertanto lo standard di riferimento e testata la sensibilità, viene individuato il cut-off, ovvero il procedimento di esclusione dei campioni che non contengono sostanze o loro metaboliti o che abbiano una concentrazione inferiore alla concentrazione soglia. Il confronto con lo standard di riferimento in rapporto diadico con i controlli di qualità contribuiscono alla Validazione del dato analitico che è sottoposto a Refertazione e trasmissione del dato. Il nucleo centrale dell’ elaborato è dedicato nella fattispecie, all’accoppiamento o ifenazione della gas cromatografia e/o cromatografia liquida ad alta efficienza con la spettrometria di massa (GC/MS - HPLC/MS) che ha esteso notevolmente le applicazioni di entrambe le tecniche.
L’elevata sensibilità consente inoltre l’identificazione ed il dosaggio di tracce di composti altrimenti non identificabili in miscele molto complesse.
Tale limite di rivelazione (identificazione) è quindi la più bassa concentrazione che permette di valutare qualitativamente la presenza o assenza di un analita e viene indicato con il termine LOD (Limit of Detection) e deve essere stabilito in ogni laboratorio in riferimento alla strumentazione che viene utilizzata. Il limite di quantificazione (LOQ - Limit of Quantitation) è la più bassa concentrazione dell’analita che può essere calcolata con precisione e accuratezza prestabilite, generalmente considerando il segnale attribuito all’analita circa 10 volte superiore alla deviazione standard del bianco.
Tuttavia il Laboratorio non fornisce esclusivamente un risultato analitico, ma l’emissione del dato è condizionata da una serie di valutazioni chimico-tossicologiche che possono essere effettuate soltanto da chi ha esperienza e bagaglio culturale idoneo. Quello che viene richiesto al Tossicologo Forense è infatti l’interpretazione del dato analitico ottenuto; l’interpretazione riguarda il significato della positività o negatività in relazione ad una serie di parametri quali ad esempio la tipologia del campione biologico esaminato e le tecniche analitiche utilizzate. I cambiamenti nel panorama dell’abuso di sostanze stupefacenti
rendono necessari programmi di controllo e di collaborazione con altri laboratori al fine di aggiornare e ottimizzare continuamente le procedure analitiche.
Lo spettrometro di massa esalta il metodo di rivelazione pur mostrando un iter distruttivo. Esso può essere associato al cromatografo liquido per la ricerca di sostanze d'abuso. Il principio di funzionamento è abbastanza semplice: il campione viene introdotto in una camera dove viene ionizzato e frammentato. Questi frammenti carichi elettricamente vengono fatti migrare e la loro velocità di frazionamento sarà in base al rapporto peso molecolare/carica. I rivelatori, per trasduzione del segnale faranno il resto ottenendo gli spettrogrammi utilissimi per le conclusioni.
Nella seconda parte del dottorato si è posto in rilievo l’aspetto tecnico della strumentazione in dotazione.
Il campione viene introdotto in modo tale che all'interno della camera sia assicurato il vuoto. Questo viene frammentato e ionizzato dallo ionizzatore. Nel nostro caso si tratta di una ionizzazione ad impatto elettronico (ESI): un filamento incandescente di tungsteno, produce degli elettroni, che viaggiano verso un anodo posto dalla parte opposta. Questa accelerazione fa viaggiare gli elettroni ad una energia molto elevata (70 eV). Poiché per ionizzare una molecola basta in genere una energia di 13-14 eV, l’analita non viene solo ionizzato, ma anche frammentato.
I frammenti raggiungono infine l’analizzatore. Esaminiamo in verità tutti i metodi di ionizzazione e tutti i tipi di analizzatori diffusi nella pratica laboratoristica.
Esistono in altri termini, diversi tipi di analizzatori, ma nel nostro caso viene utilizzato per l’ifenazione un analizzatore a quadrupolo e ad esso si è dedicato maggiore approfondimento riguardo alla struttura e alla funzione. Questo è costituito da quattro barre metalliche al molibdeno che delimitano il cammino percorso dagli ioni nel tragitto tra ionizzatore e rivelatore.
Durante questo tragitto, il potenziale elettromagnetico delle barre è mantenuto oscillante, ovvero se nell’istante T0 due barre sono positive e altre due sono negative, all’istante T1 quelle positive diventeranno negative e viceversa.
Agendo sulla frequenza di queste oscillazioni, i frammenti si muoveranno con un tragitto sinusoidale verso il rivelatore. Quindi tali frammenti si muoveranno ad una velocità in funzione della carica e del peso molecolare.
Il segnale emesso dal fotomoltiplicatore (il rivelatore), viene elaborato mediante un computer il quale sarà in grado di utilizzare il segnale per tracciare lo spettro di massa.
Presso il nostro servizio di Tossicologia le analisi in HPLC-ESI-MS/MS sono effettuate attraverso un sistema UHPLC UltiMate 3000 di DIONEX con controllo remoto (via software di gestione strumentale o proprio comando manuale), equipaggiato di auto campionatore termostatato e modulo per l’alloggiamento della colonna analitica egualmente termostatato. Il sistema UltiMate 3000 HPLC offre la compatibilità UHPLC su tutti i moduli, assicurando massime prestazioni per tutti gli utenti e tutti i laboratori. Il sistema HPLC è stato interfacciato ad uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo API 3200 Q TRAP, fornito di sorgente ionica ESI.
Lo spettrometro di massa è dotato di una pompa per infusione aggiunta per condurre esperimenti in regime di FIA (Flow Injection Analysis). Il sistema API 3200 Small Benchtop a disposizione, aumenta il potere e il rendimento della Spettrometria di Massa mediante la presenza del triplo quadrupolo. L’operatore può scegliere una risoluzione più alta in base ai problemi da risolvere (ad es. fissando la risoluzione singolarmente caricata a 0.5-0,6 uma o amu o atomic mass unit (unità di massa atomica) completamente sintonizzato con metà del peso molecolare, può aiutare nella ricerca di ioni a doppia carica. La bassa risoluzione specialmente in Q3 ( triplo quadrupolo), spesso migliora la sensibilità nella MRM (Multiple Reaction Monitoring), modalità usata per l’analisi quantitativa. La MRM è come ricordato, l’applicazione della SRM (Selected Reaction Monitoring) agli ioni prodotti da uno o più ioni precursori.
Nel sistema UHPLC ultimate 3000 di DIONEX la separazione è stata ottenuta utilizzando una colonna cromatografica analitica Kinetex Phenomenex 2.6U XB- C18 100 A (100 x 2,10 mm), preceduta da una precolonna Phenomenex STRATA-X CW 25 micron on line Extraction 20, 2 mm.
Partendo dagli standard chimici e dagli analoghi deuterati (standard interni), a diversa concentrazione degli analiti in studio, si approntano delle soluzioni in Fase Mobile.
Sia nel Loading (caricamento della precolonna), che nella cromatografia in atto.
Iniziamo aggiungendo a 1 ml di urina 30 L delle soluzioni metanoliche di partenza,
precedentemente descritte, degli analiti, e 30 L delle soluzioni di standard interni.
Mediante la reazione di idrolisi così descritta è stato possibile staccare l’analita dal composto.
Il sistema MQ4 in uso riesce a determinare i vari elementi fino a concentrazioni inferiori ad una parte per miliardo o PPB (below one part for billion).
Sicché il percorso del Drug Screening Validation è stato applicato ai seguenti analiti.
Amfetamine
Metamfetamine
MDA
MDMA
EDDP
Morfina
Benzoilecgonina
Codeina
Cocaina
Metadone
THC COOH
LSD
NORBUPRENORFINA
L’intera procedura on line SPE UHPLC-MS/MS viene applicata ai campioni dei singoli standard in urina precedentemente idrolizzati e a campioni di mix contenenti gli analiti considerati a diverse concentrazioni.
L’estrazione in fase solida (SPE) è un estrazione per adsorbimento, un processo fisico tra una fase solida e una liquida, in cui la fase solida ha un’affinità maggiore per il composto da isolare, rispetto al solvente in cui lo stesso composto è sciolto. L’adsorbente C18( colonna cromatografica) legato a gruppi non polari permette un buon assorbimento e una buona separazione cromatografica dell’HPLC.
Nel nostro laboratorio al termine del percorso attraverso API3200QT, gli ioni vengono segnalati come Extracted ion chromatogram (XIC) tramite la MRM (Multiple Reaction Monitoring), cioè l’applicazione della SRM (Selected Reaction Monitoring) agli ioni prodotti da uno o più ioni precursori. In una ricerca analitica di dati si usano campioni standard per costruire dei grafici "dose/risposta" che rappresentano delle rette o curve di calibrazione. I risultati ottenuti hanno permesso di determinare i punti della curva: 10, 30 75, 150, 300 ng/ml dimostrano una buona linearità ( LOL). Il limite di rivelabilità (LOD): 5 ng/ml. Il limite di quantificazione (LOQ) : 10 ng/ml. In conclusione, il contributo innovativo nell’ambito della Tossicologia Forense, è stato quello di riuscire ad ottenere una curva di calibrazione, idonea alla rapida esecuzione dei test di conferma ai fini clinico-forensi.

The present work arose from experiences and studies carried out during a PhD course at the UOC Toxicology Clinical Analysis Laboratory of the Hospital of Belcolle, ASL Viterbo.
In particular, we developed the validation method applied in the research of many analytes in the urine matrix, indicating the presence of even the lowest traces of these, in the screening of addiction substances.
The first part of the paper describes the daily activities of a forensic toxicology laboratory diagnostics in the field of forensic medicine, current Regulations and the Guidelines and Standards for ISO certification. Essentially it follows the process undergone by the sample organic: from its choice for the collection and to the chain of custody, that guarantee of the genuineness of the procedures from all points of view. In reference to the real Chemical and Toxicological Analysis I will refer to the choice of the type of analysis, distinguishing those of the first screening ( immunochemical methods ) from those of acknowledgment (gas chromatography and liquid chromatography coupled with mass spectrometry) which specifically concern my work. Having therefore fixed the reference standard and tested the sensitivity, the cut-off is detected, i.e. the process of exclusion of the samples that do not contain substances or their metabolites or which have a concentration below the threshold concentration. The comparison with the reference standard in the dyadic relationship with the quality controls contribute to the validation of analytical data that is submitted to Reporting and transmission of the data. The core of my thesis is devoted mostly to the coupling or ifenation of gas chromatography and / or high- performance liquid chromatography with mass spectrometry (GC / MS - HPLC/MS), which has significantly extended the applications of both techniques. The high sensitivity also allows the identification and dosage of traces of compounds not otherwise identifiable in very complex mixtures.
This limit of detection (identification) is then the lowest concentration that allows to assess the presence or absence of an analyte qualitatively and is indicated with the term LOD (Limit of Detection) and must be determined in each laboratory in reference to the instrumentation which is being used. The limit of quantification (LOQ - Limit of Quantitation ) is the lowest concentration of analyte that can be calculated with predetermined precision and accuracy, generally considering the signal attributed to the analyte wich is about 10 times higher than the standard deviation of the blank.
However, the laboratory does not only provides an analytical result, but the output of the data is conditioned by a series of chemical- toxicological assessments that can be performed only by those with experience and the necessary know how. What is required to Forensic Toxicologist is in fact the interpretation of the analytical data obtained; the interpretation regards the meaning of the positivity or negativity in relation to a series of parameters such as the type of biological sample examined and the analytical techniques used. Because of the changes in the field of drug abuse, control programs and collaboration with other laboratories are needed in order to continuously update and optimize the analytical procedures.
The mass spectrometer enhances the detection method although showing a destructive process . It can be associated with the liquid chromatograph for the detection of addiction substances . The operating principle is simple enough : the sample is introduced into a chamber where it is ionized and fragmented. These electrically charged fragments are made to migrate , and their rate of division will be based on the ratio molecular weight / charge . The detectors for signal transduction will do the rest obtaining spectrograms useful for conclusions. In the second part of the PhD, it has been emphasized the technical aspect of the equipment supplied. The sample is introduced in such a way that inside the chamber the vacuum is ensured. This is fragmented and ionized by the ionizer. In our case it is an electron-impact ionisation (ESI) : an incandescent filament of tungsten, produces electrons, travelling towards an anode situated opposite. This acceleration makes the electrons travelling at a very high energy (70 eV ) . Since to ionize a molecule an energy of 13-14 eV is required , the analyte is not only ionized but also fragmented.
The fragments eventually reach the analyzer . Actually we will examine all the methods of ionization and all type of analyzers common in laboratory practice investigations.
In other words, there are different types of analyzers, but in our case for the ifenation a quadrupole analyzer is used and a deeper analysis has been devoted to it, with respect to structure and function. This consists of four molybdenum metal bars that surround the path taken by the ions in the path between the ionizer and the detector. During this journey , the electromagnetic potential of the bars is kept oscillating , or if in the moment T0 two bars are positive and two are negative , the positive T1 instantly becomes negative and vice versa. Acting on the frequency of these oscillations , the fragments will move with a sinusoidal path toward the detector. So these fragments will move at a speed according to the charge and molecular weight. The signal from the photomultiplier ( the detector ) , is processed by a computer which will be able to use the signal to track the mass spectrum.
At our Toxicology laboratory HPLC-ESI-MS/MS tests are performed using a UltiMate 3000 UHPLC system of DIONEX with remote control ( via management software instrument or its override) , equipped with auto sampler thermostatically controlled and a module for the ' housing of the analytical column also with thermostat. The UltiMate 3000 HPLC system offers UHPLC compatibility across all modules , ensuring maximum performance for all users and all laboratories . The HPLC system was interfaced to a triple quadrupole mass spectrometer API 3200 Q TRAP, equipped with ESI ion source.
The mass spectrometer is equipped with a pump for infusion added to conduct experiments under FIA ( Flow Injection Analysis) . The system API 3200 Small Benchtop available, increases the power and performance of the Mass Spectrometry by the presence of the triple quadrupole . The operator can choose a higher resolution depending on the issues to be solved (eg . Fixing the resolution individually loaded 0.5-0,6 atomic mass unit, or amu ( atomic mass unit ) tuning with half the molecular weight; this can help in the search for double charge ions . The low resolution especially in Q3, often improves sensitivity in the MRM ( multiple
reaction monitoring ) mode used for quantitative analysis. The above mentioned MRM is the application of SRM
( Selected Reaction Monitoring ) to the ions produced by one or more precursor ions.
In the system 3000 of DIONEX UHPLC ultimate separation was achieved using a column chromatographic analytical Phenomenex 2.6U Kinetex XB- C18 100 A ( 100 x 2.10 mm ), preceded by a precolumn Phenomenex STRATA -X CW 25 microns on line 20 Extraction, 2 mm. Starting from the chemical standards and the deuterated analogues ( internal standard ) at different concentrations of the analytes, analyzed solutions in mobile phase are prepared. Both in Loading (load guard), and in the chromatography.
We will start by adding to 1 ml of urine, 30 L of methanol solutions previously described, the analytes, and 30 L of the solutions of internal standards.
By the hydrolysis reaction it has been possible to detach the analyte from the compound The system in use MQ4 can determine the various elements up to concentrations of less than one part per billion or PPB ( below one part for billion).
So the path of the Drug Screening Validation. was applied to the following analytes:
Amphetamines methamphetamine MDA MDMA EDDP morphine benzoylecgonine codeine Cocaine methadone
THC COOH
LSD Norbuprenorphine The whole procedure on-line SPE UHPLC-MS/MS is applied to samples of each standard in previously hydrolyzed urine samples and to mix samples containing the analytes considered at different concentrations . The solid phase extraction (SPE) is an extraction for adsorption, a physical process between a solid phase and a liquid, wherein the solid phase has a greater affinity for the compound to be isolated, as regards the solvent in which the same compound is dissolved. The adsorbent C18 bound to non polar groups allows good absorption and good chromatographic separation by HPLC.
In our laboratory at the end of the path through API3200QT , the ions are reported as Extracted ion
chromatogram ( XIC ) using MRM (Multiple Reaction Monitoring ) , i.e. the application of the SRM (Selected Reaction Monitoring ) ions produced by one or more precursor ions .
In a research analysis of data standard samples are used to build charts " dose / response " that represent the calibration curves or straight lines.
The results obtained have allowed us to determine the calibration curve: 10, 30 75, 150, 300 ng/ml, show good linearity (LOL). The Limit of Detection (LOD): 5 ng/ml. The limit of quantification (LOQ): 10 ng/ml. In conclusion, the innovative contribution in the field of Forensic Toxicology, allowed to obtain a calibration curve, suitable for the rapid execution of the confirm tests for clinical and forensic purposes.
Description: 
Dottorato di ricerca in Evoluzione biologica e biochimica
URI: http://hdl.handle.net/2067/2843
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