Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2842
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dc.contributor.advisorSoddu, Silvia-
dc.contributor.authorGatti, Veronica-
dc.date.accessioned2016-08-04T07:15:40Z-
dc.date.available2016-08-04T07:15:40Z-
dc.date.issued2014-06-19-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/2067/2842-
dc.descriptionDottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulareit
dc.description.abstractLa chinasi HIPK2 è stata originariamente identificata per la sua capacità di interagire con i fattori omeodominio. HIPK2 lega e fosforila un numero crescente di bersagli ed è coinvolta nella regolazione della sopravvivenza cellulare e della proliferazione durante lo sviluppo ed in risposta a danno genotossico o ipossia. In questo lavoro ci siamo focalizzati su due differenti meccanismi di regolazione dell’attività di HIPK2: la fosforilazione e lo splicing alternativo. Per studiare la fosforilazione abbiamo lavorato con la proteina full-lenght. L’analisi mediante spettrometria di massa della proteina ricombinante prodotta in cellule di mammifero, eGST-HIPK2 ha permesso l’identificazione di 22 si ti di fosforilazione distribuiti lungo tutti i domini della proteina. Tra questi siti, abbiamo identificato la Y354 che fa parte di una sequenza estremamente conservata nella maggior parte delle chinasi detta loop di attivazione. Abbiamo dimostrato che la fosforilazione della Y del loop di attivazione è un evento autocatalitico fondamentale per il conseguimento dell’attività chinasica, della specificità di substrato e della corretta localizzazione cellulare. Infatti, l’inibizione della fosforilazione della Y354 causa la perdita di attività chinasica sui substrati p53 e p63 e l’acquisizione di attività chinasica aberrante su se stessa. L’auto-fosforilazione fuori bersaglio induce una forte delocalizzazione citoplasmatica e la formazione di aggregati proteici che ricordano le osservazioni ottenute mediante immunoistochimica su diversi tumori umani. Sebbene ipotizzata da tempo, la presenza di isoforme diverse di HIPK2 non è stata verificata sistematicamente. In questo lavoro abbiamo mostrato che il gene HIPK2 umano è soggetto a regolazione mediante splicing alternativo e che trascrive, oltre al messaggero full length, almeno altre due isoforme differenti. Un’isoforma perde parte dell’esone 8 (Δe8) che codifica per una porzione del dominio di interazione per le proteine omeobox; l’altra isoforma mantiene l’introne 13 (i13) che contiene un codone di stop prematuro che causa la perdita della parte C-terminale della proteina. Abbiamo mostrato che i livelli di messaggero di ciascuna isoforma sono strettamente dipendenti dai livelli delle altre suggerendo l’esistenza di una regolazione complessa. A questa variabilità si aggiunge un ulteriore livello di complessità dato dalla diversa regolazione mediante modificazioni posttraduzionali. Infatti, esperimenti di Western blot su estratti nucleari e citoplasmatici, suggeriscono l’esistenza di almeno due diverse forme di proteine full-length, una caratterizzata da un pattern di modificazioni post-traduzionali tale da farla localizzare preferenzialmente nel nucleo ed una esclusivamente nel citoplasma. Inoltre, abbiamo osservato anche l’esistenza di un’isoforma Δe8 con una localizzazione esclusivamente nucleare nelle cellule normali che viene parzialmente delocalizzata nel citoplasma in cellule tumorali. Esperimenti funzionali preliminari, suggeriscono che le isoforme di HIPK2 potrebbero avere funzioni differenti, come descritto anche per altri oncosoppressori. In particolare è emerso che la forma i13 è la più attiva nell’induzione di morte cellulare.it
dc.description.abstractHIPK2 is an evolutionarily conserved DYRK-like kinase originally identified for its capacity to interact with homeodomain transcription factors. HIPK2 binds and phosphorylates a still enlarging body of targets and is involved in the regulation of cell survival and proliferation during development and in response to genotoxic damage or hypoxia. In this study, we focused our attention on two different regulatory mechanisms of HIPK2 activity: phosphorylation and alternative splicing. To analyze HIPK2 phosphorylation pattern we worked with full-length protein. Mass spectrometric analysis of GST-tagged wild-type HIPK2, produced and purified from mammalian cells, allowed the identification of 22 phosphorylation sites spread throughout all protein domains. Among these sites, we identified Y354 that belongs to an aminoacidic sequence conserved in most protein kinases called activation loop. We demonstrated that activation-loop Y phosphorylation is an autocatalytic event important for kinase activity achievement, substrate specificity and correct cellular localization. Indeed, inhibition of activation-loop Y phosphorylation induces a strong decrease in the phosphorylation of the two specific substrates, p53 and p63 and the acquisition of aberrant Y and S/T kinase activity. Out-of-target phosphorylation causes a strong cytoplasmic delocalization together with protein aggregates formation resembling the observation made in different tumors by immunohistochemistry. Although the existence of HIPK2 splicing isoforms has been hypothesized, it has not systematically verified thus far. In this work we showed that HIPK2 human gene is subjected to alternative splicing regulation and that it encodes, besides full-length mRNA, at least two more isoforms. The first alternative splicing consists in the alternative 3’-splice site selection in exon 8 (Δe8) causing the loss of 81 bps and 27 aminoacids encoding a portion of homeodomain interacting domain; the second alternative splicing consists in the retention of intron13 (i13). Because of a stop codon after 89 bps of the intron, HIPK2i13 protein loses its C-terminal part and gains 29 new aminoacids. We showed that mRNA levels of each isoform are strictly dependent on the amount of other isoforms messengers, suggesting a complex regulation. A further layer of complexity, due to different post-translational modifications, strongly contributes to this variability. Indeed, Western blot experiments on nuclear and cytoplasmic extracts suggest the existence of at least two different forms of full-length protein; one of them has such a post-translational modification pattern that it localize preferentially in the nucleus and the other one exclusively in the cytoplasm. Moreover, we observed a Δe8 isoform with an exclusively nuclear localization in normal cells that is partially delocalized in the cytoplasm in tumor cells. Preliminary functional experiments suggest that HIPK2 splicing isoforms could have different functions, as described for other tumor suppressor. In particular, we showed that i13 has the strongest cell death activity.en
dc.language.isoiten
dc.publisherUniversità degli studi della Tuscia - Viterboit
dc.relation.ispartofseriesTesi di dottorato di ricerca. 26. ciclo-
dc.subjectChinasiit
dc.subjectHIPK2-
dc.subjectAutofosforilazioneit
dc.subjectSplicing alternativoit
dc.subjectKinaseen
dc.subjectAutophosphorylationen
dc.subjectAlternative splicingen
dc.subjectBIO/11it
dc.titleMeccanismi di regolazione della chinasi HIPK2it
dc.title.alternativeMechanisms of HIPK2 regulationen
dc.typeDoctoral Thesisen
dc.rights.accessRightsinfo:eu-repo/semantics/openAccessen
item.fulltextWith Fulltext-
item.openairetypeDoctoral Thesis-
item.cerifentitytypePublications-
item.grantfulltextopen-
item.languageiso639-1it-
item.openairecristypehttp://purl.org/coar/resource_type/c_18cf-
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