Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2842
Title: Meccanismi di regolazione della chinasi HIPK2
Other Titles: Mechanisms of HIPK2 regulation
Authors: Gatti, Veronica
Keywords: Chinasi;HIPK2;Autofosforilazione;Splicing alternativo;Kinase;Autophosphorylation;Alternative splicing;BIO/11
Issue Date: 19-Jun-2014
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 26. ciclo
Abstract: 
La chinasi HIPK2 è stata originariamente identificata per la sua capacità di interagire con i fattori
omeodominio. HIPK2 lega e fosforila un numero crescente di bersagli ed è coinvolta nella regolazione
della sopravvivenza cellulare e della proliferazione durante lo sviluppo ed in risposta a danno
genotossico o ipossia. In questo lavoro ci siamo focalizzati su due differenti meccanismi di regolazione
dell’attività di HIPK2: la fosforilazione e lo splicing alternativo.
Per studiare la fosforilazione abbiamo lavorato con la proteina full-lenght. L’analisi mediante
spettrometria di massa della proteina ricombinante prodotta in cellule di mammifero, eGST-HIPK2 ha
permesso l’identificazione di 22 si ti di fosforilazione distribuiti lungo tutti i domini della proteina. Tra
questi siti, abbiamo identificato la Y354 che fa parte di una sequenza estremamente conservata nella
maggior parte delle chinasi detta loop di attivazione. Abbiamo dimostrato che la fosforilazione della Y
del loop di attivazione è un evento autocatalitico fondamentale per il conseguimento dell’attività
chinasica, della specificità di substrato e della corretta localizzazione cellulare. Infatti, l’inibizione della
fosforilazione della Y354 causa la perdita di attività chinasica sui substrati p53 e p63 e l’acquisizione di
attività chinasica aberrante su se stessa. L’auto-fosforilazione fuori bersaglio induce una forte
delocalizzazione citoplasmatica e la formazione di aggregati proteici che ricordano le osservazioni
ottenute mediante immunoistochimica su diversi tumori umani.
Sebbene ipotizzata da tempo, la presenza di isoforme diverse di HIPK2 non è stata verificata
sistematicamente. In questo lavoro abbiamo mostrato che il gene HIPK2 umano è soggetto a
regolazione mediante splicing alternativo e che trascrive, oltre al messaggero full length, almeno altre
due isoforme differenti. Un’isoforma perde parte dell’esone 8 (Δe8) che codifica per una porzione del
dominio di interazione per le proteine omeobox; l’altra isoforma mantiene l’introne 13 (i13) che
contiene un codone di stop prematuro che causa la perdita della parte C-terminale della proteina.
Abbiamo mostrato che i livelli di messaggero di ciascuna isoforma sono strettamente dipendenti dai
livelli delle altre suggerendo l’esistenza di una regolazione complessa. A questa variabilità si aggiunge
un ulteriore livello di complessità dato dalla diversa regolazione mediante modificazioni posttraduzionali.
Infatti, esperimenti di Western blot su estratti nucleari e citoplasmatici, suggeriscono
l’esistenza di almeno due diverse forme di proteine full-length, una caratterizzata da un pattern di
modificazioni post-traduzionali tale da farla localizzare preferenzialmente nel nucleo ed una
esclusivamente nel citoplasma. Inoltre, abbiamo osservato anche l’esistenza di un’isoforma Δe8 con una
localizzazione esclusivamente nucleare nelle cellule normali che viene parzialmente delocalizzata nel
citoplasma in cellule tumorali. Esperimenti funzionali preliminari, suggeriscono che le isoforme di
HIPK2 potrebbero avere funzioni differenti, come descritto anche per altri oncosoppressori. In
particolare è emerso che la forma i13 è la più attiva nell’induzione di morte cellulare.

HIPK2 is an evolutionarily conserved DYRK-like kinase originally identified for its capacity to interact
with homeodomain transcription factors. HIPK2 binds and phosphorylates a still enlarging body of
targets and is involved in the regulation of cell survival and proliferation during development and in
response to genotoxic damage or hypoxia. In this study, we focused our attention on two different
regulatory mechanisms of HIPK2 activity: phosphorylation and alternative splicing. To analyze HIPK2
phosphorylation pattern we worked with full-length protein.
Mass spectrometric analysis of GST-tagged wild-type HIPK2, produced and purified from
mammalian cells, allowed the identification of 22 phosphorylation sites spread throughout all protein
domains. Among these sites, we identified Y354 that belongs to an aminoacidic sequence conserved in
most protein kinases called activation loop. We demonstrated that activation-loop Y phosphorylation is
an autocatalytic event important for kinase activity achievement, substrate specificity and correct
cellular localization. Indeed, inhibition of activation-loop Y phosphorylation induces a strong decrease
in the phosphorylation of the two specific substrates, p53 and p63 and the acquisition of aberrant Y and
S/T kinase activity. Out-of-target phosphorylation causes a strong cytoplasmic delocalization together
with protein aggregates formation resembling the observation made in different tumors by
immunohistochemistry.
Although the existence of HIPK2 splicing isoforms has been hypothesized, it has not
systematically verified thus far. In this work we showed that HIPK2 human gene is subjected to
alternative splicing regulation and that it encodes, besides full-length mRNA, at least two more isoforms.
The first alternative splicing consists in the alternative 3’-splice site selection in exon 8 (Δe8) causing
the loss of 81 bps and 27 aminoacids encoding a portion of homeodomain interacting domain; the
second alternative splicing consists in the retention of intron13 (i13). Because of a stop codon after 89
bps of the intron, HIPK2i13 protein loses its C-terminal part and gains 29 new aminoacids. We showed
that mRNA levels of each isoform are strictly dependent on the amount of other isoforms messengers,
suggesting a complex regulation. A further layer of complexity, due to different post-translational
modifications, strongly contributes to this variability. Indeed, Western blot experiments on nuclear and
cytoplasmic extracts suggest the existence of at least two different forms of full-length protein; one of
them has such a post-translational modification pattern that it localize preferentially in the nucleus and
the other one exclusively in the cytoplasm. Moreover, we observed a Δe8 isoform with an exclusively
nuclear localization in normal cells that is partially delocalized in the cytoplasm in tumor cells.
Preliminary functional experiments suggest that HIPK2 splicing isoforms could have different functions,
as described for other tumor suppressor. In particular, we showed that i13 has the strongest cell death
activity.
Description: 
Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare
URI: http://hdl.handle.net/2067/2842
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