Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2067/2823
Title: Genetic and cytological analysis of two male sterile mutant strains of Drosophila melanogaster
Other Titles: Analisi genetica e citologica di due linee mutanti maschio-sterile di Drosophila melanogaster
Authors: Fabbretti, Fabiana
Keywords: Spermatogenesis;Meiosis;RAE1;Nuclear lamina;Drosophila;Lamina nucleare;Spermatogenesi;Meiosi;BIO/18
Issue Date: 19-Jun-2014
Publisher: Università degli studi della Tuscia - Viterbo
Series/Report no.: Tesi di dottorato di ricerca. 26. ciclo
Abstract: 
Spermatogenesis, the production of male functional gametes from germinal stem
cells, represents one of the most dramatic examples of cell differentiation. The
availability of Drosophila melanogaster mutants defective for specific
spermatogenesis stages, the short Drosophila life cycle, the availability of genetic
resources, like a fully sequenced genome, and the gene and pathway conservation
with humans, make this insect particularly suitable to study the genetic control of the
spermatogenesis process. The aim of my PhD research project was the analysis of two
mutant strains (ms(2)Z5584 and ms(2)Z1168) belonging to a unique collection of 13
ethyl-methansulfonate (EMS)-induced male sterile recessive mutants identified in a
large screening for male-sterile mutations on chromosome 2 and 3 (Wakimoto et al.,
2004). From a preliminary cytological screen of mutations, a general and common
aberrant phenotype affecting the entry into and progression of the meiotic cell cycle
was identified: mutants skipped one or both meiotic divisions but carried out the
differentiation of spermatids although with anomalies.
The ms(2)Z5584 mutant strain was previously genetically and cytologically
characterized and a point mutation in rae1 gene was identified as responsible of the
aberrant phenotypes (Volpi et al., 2013). Starting from that evidences, I confirmed the
identification of rae1 as the gene underlying the ms(2)Z5584 mutant phenotype, by
RNAi silencing of the wild type rae1. Then, I uncovered the localization pattern of
RAE1 during meiotic cell cycle by GAL4/UAS system allowing the expression of
UASGFP-rae1 transgene under both testis-specific and constitutive drivers. Finally, I
performed the phenotype rescue of the ms(2)Z5584 mutant by using of UASGFP-rae1
transgene.
The ms(2)Z1168 mutant strain was cytologically characterized by
immunohistochemistry technique using antibodies against several structures involved
in male meiosis and confocal microscopy. The ms(2)Z1168 mutant exhibited
anomalies in nuclear lamina structure together with chromatin condensation defects.
The ms(2)Z1168 genetic analysis narrowed the gene locus to a genomic region
containing 12 genes. The gene identification was further refined by reverse genetic
approach using RNA interference and by sequencing. Mutations affecting a
regulatory region of CG7810 gene were identified in the mutant genome. Finally,
since the ms(2)Z1168 mutant exhibited nuclear lamina defects, an accurate nuclear
lamina characterization during wild type meiosis and spermatogenesis was performed.
The study of mutant strains disrupted for some aspects of spermatogenesis
process allows a broader understanding of the genetic and molecular factors involved
in the regulation and in the execution of male meiosis and spermiogenesis.

La spermatogenesi, il processo di produzione di gameti funzionali da cellule staminali
germinali, rappresenta uno degli esempi più significativi di differenziamento
cellulare. La disponibilità di mutanti che coinvolgono specifiche fasi della
spermatogenesi, insieme ad un ciclo vitale breve, alla disponibilità di risorse
genetiche, un genoma completamente sequenziato e la conservazione con l’uomo di
geni e processi, rende la Drosophila un organismo particolarmente adatto per lo studio
del processo di spermatogenesi. Lo scopo del presente progetto di ricerca di dottorato
riguarda l'analisi di due ceppi mutanti di Drosophila melanogaster appartenenti ad
una collezione unica di 13 mutanti recessivi maschio-sterile indotti tramite
mutagenesi chimica con etilmetansulfonato (EMS), identificati tramite un largo
screening di mutazioni maschio-sterile del cromosoma 2 e 3 (Wakimoto et al. , 2004).
Un’analisi citologica preliminare delle mutazioni ha evidenziato un fenotipo aberrante
generale che colpisce l'entrata in meiosi e la progressione del ciclo cellulare: i mutanti
saltano una o entrambe le divisioni meiotiche effettuando, anche se con anomalie, il
differenziamento degli spermatidi. Il ceppo mutante ms(2)Z5584 è stato
precedentemente caratterizzato sia geneticamente che citologicamente. E’ stata
individuata una mutazione puntiforme nel gene rae1 che determina fenotipi aberranti
a carico di tutto il processo di spermatogenesi (Volpi et al., 2013). A partire da queste
evidenze, ho effettuato una serie di esperimenti di interferenza dell’RNA per il gene
rae1 allo scopo di confermare che la mutazione identificata a carico del suddetto gene
fosse proprio quella responsabile del fenotipo mutante mostrato dal ceppo
ms(2)Z5584. In secondo luogo, è stata effettuata un’ analisi di localizzazione della
proteina RAE1 durante il ciclo cellulare meiotico attraverso il sistema GAL4/UAS
che permette l'espressione del costrutto transgenico UASGFP-rae1 sia attraverso un
driver testicolo-specifico che costitutivo. Infine, è stato effettuato un esperimento di
“rescue” del fenotipo nel ceppo mutante ms(2)Z5584 al fine di verificare se il
transgene UASGFP-rae1 fosse in grado di ripristinare il fenotipo selvatico nel
suddetto mutante. Il secondo ceppo mutante ms(2)Z1168 è stato caratterizzato a
livello citologico e genetico. L'analisi citologica è stata eseguita con la tecnica dell’
immunoistochimica e i preparati sono stati analizzati mediante microscopia confocale.
Il ceppo mutante ms(2)Z1168 mostra anomalie a carico della struttura della lamina
nucleare insieme a difetti di condensazione della cromatina. Inoltre, è stata effettuata
una accurata caratterizzazione del comportamento lamina nucleare durante il normale
processo di spermatogenesi e in meiosi. L'identificazione del gene responsabile del
fenotipo mutante del ceppo ms(2)Z1168 è stata effettuata con un approccio genetico
utilizzando l’interferenza dell’ RNA e con approccio molecolare tramite
sequenziamento genico. Lo studio di ceppi mutanti con difetti a carico di stadi precisi
del processo di spermatogenesi consente di ottenere una più ampia comprensione dei
fattori genetici e molecolari coinvolti nella regolazione e nella esecuzione della
meiosi maschile e spermiogenesi.
Description: 
Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare
URI: http://hdl.handle.net/2067/2823
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